一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签及其应用。所述标签为Ebolavirus GP或Monofoil

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签及其应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签及其应用。
技术背景
[0002]Trimer
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Tag(蛋白质三聚体化)技术可以将任意目的蛋白三聚体化，从而可以靶向天然依赖蛋白质三聚体化功能的一些靶点或者用于制备新型疫苗。使用Trimer
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Tag技术平台能够获得稳定的共价连接的三聚体病毒抗原蛋白或者配体蛋白，但是Trimer
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Tag三聚化蛋白主要针对一些天然构象为三聚化的目的蛋白，包括一些病毒蛋白(新冠S蛋白、呼吸合胞病毒和流感病毒等)和疾病生物学靶点(OX40、TNFSF和TL1A/DR3等)，目前其研发管线包括六种Trimer
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Tag
TM
亚单位候选疫苗、四种Trimer
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Tag
TM
肿瘤治疗候选产品以及三种Fc融合蛋白候选产品。该技术开发的三聚体化蛋白对三聚体依赖性疾病靶点具有很强的有效性及良好的安全性，目前三聚体蛋白高度依赖Trimer
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Tag技术，制备三聚体融合蛋白难以脱离该技术平台。
[0003]寻找新的三聚体标签用于三聚体蛋白，摆脱对Trimer
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Tag的技术依赖，具有重要的研究价值。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签，所述标签为Ebolavirus GP或Monofoil
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4P，所述Ebolavirus GP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Monofoil
‑
4P的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0005]本专利技术还提供一种多核苷酸，其编码如上所述的三聚体标签Ebolavirus GP或编码三聚体标签Monofoil
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4P。
[0006]一种表达载体，其包含如上所述的多核苷酸。
[0007]一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体。
[0008]优选的，所述宿主细胞为表达外源蛋白的宿主细胞，如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。
[0009]本专利技术还提供一种融合蛋白，其包括如上所述的Ebolavirus GP或Monofoil
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4P任一项三聚体标签，以及连接在所述Ebolavirus GP或Monofoil
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4P氨基酸序列N端的MBP标签。
[0010]本专利技术还提供三聚体标签Ebolavirus GP或Monofoil
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4P在制备三聚体化目的蛋白中的应用或在制备三聚体重组蛋白疫苗中的应用。
[0011]本专利技术的有益效果在于：
[0012]本专利技术提供的两个三聚体标签Ebolavirus GP和Monofoil
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4P，Ebolavirus GP是针对埃博拉病毒GP2蛋白设计的一个n
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三聚体肽，Monofoil
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4P是从头设计的一个蛋白，晶体结构显示其为三聚体形式。实验证明，两个三聚体标签均能够将目的蛋白三聚体化，从而
可以靶向天然依赖蛋白质三聚体化功能的一些靶点或者用于制备新型疫苗。
附图说明
[0013]图1为Ebolavirus GP和Monofoil
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4P镍柱纯化结果。图中A为MBP
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Ebolavirus GP Prehairpin Intermediate Mimic蛋白纯化镍柱纯化结果图；B为MBP
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Monofoil
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4P homo
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trimer蛋白镍柱纯化结果图。
[0014]图2为MBP
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Ebolavirus GP(图中A)及MBP
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Monofoil
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4P(图中B)的Q柱纯化结果图。
[0015]图3为MBP
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Ebolavirus GP(图中A)及MBP
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Monofoil
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4P(图中B)的分子筛鉴定结果图。
[0016]图4为MBP
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Ebolavirus GP(图中A)及MBP
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Monofoil
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4P(图中B)的蛋白质交联(crosslink)鉴定结果图。
具体实施方式
[0017]为了便于理解，下面结合试验对本专利技术的技术方案做出更为具体的说明：
[0018]1.设计MBP
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Ebolavirus GP及MBP
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Monofoil
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4P序列
[0019]设计引物，将麦芽糖结合蛋白(MBP)、Ebolavirus GP、Monofoil
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4P的基因序列插入到大肠杆菌表达载体PET30a中，MBP分别连接Ebolavirus GP和Monofoil
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4P的N端，Ebolavirus GP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Mono foil
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4P的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。构建好的质粒经测序后保存。
[0020]2.MBP
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Ebolavirus GP及MBP
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Monofoil
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4P融合蛋白的表达和纯化
[0021]将上述测序成功的载体转化到感受态Rosetta中，大规模培养大肠杆菌，通过IPTG诱导目的蛋白的表达，诱导表达过夜后收集菌体，通过超声破碎的方法裂解菌体，然后采用镍柱对上清中的融合蛋白进行纯化，纯化图如图1所示。
[0022]随后对目的蛋白再采用Q柱进行进一步纯化，结果如图2所示。从上清中，我们获得了高纯度MBP
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Ebolavirus GP及MBP
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Monofoil
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4P蛋白。
[0023]3.融合蛋白蛋白状态分析
[0024]1)分子筛分析：分子筛是根据分子大小进行分离的方法，其中的填料是一种聚糖的均匀介质，当大小不同的混合物进入分子筛柱时，大的分子因为路径短而先出来，而小分子在柱中的路径长而后出来。通过此方法主要用于区分蛋白的状态，蛋白形成聚合体时分子量大而在分子筛中先出来。
[0025]取1mg MBP
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Ebolavirus GP及MBP
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Monofoil
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4P融合蛋白，通过loop注入分子筛柱中，在AKTA(蛋白纯化系统)中运行程序，纯化图如图3所示。分子筛结果表明，获得的融合蛋白是较为单一状态的MBP
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Ebolavirus GP和MBP
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备三聚体融合蛋白的三聚体标签，其特征在于，所述标签为Ebolavirus GP或Monofoil
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4P，所述Ebolavirus GP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Monofoil
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4P的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的三聚体标签Ebolavirus GP或编码三聚体标签Monofoil
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4P；编码所述三聚体标签Ebolavirus GP的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述三聚体标签Monofoil
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4P的多核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种表达载体，其包含如权利要求2所述的任一种多核苷酸。4.一种宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚玉花，赵丹，
申请(专利权)人：安徽金百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：