一种抗流感病毒多肽的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，特别涉及一种抗流感病毒多肽的制备方法及应用，与现有技术相比，本发明专利技术首次将昆虫杆状病毒表达系统与IMPACT纯化系统结合起来制备抗病毒多肽，通过昆虫杆状病毒表达系统表达多肽，经信号肽分泌到上清中，通过IMPACT系统进行自切割纯化，将高效表达与高效纯化相结合，可以高效生产抗病毒多肽，可抑制流感病毒的cRNA及vRNA合成，具有显著的抑制病毒效果。有显著的抑制病毒效果。有显著的抑制病毒效果。

【技术实现步骤摘要】
一种抗流感病毒多肽的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别涉及一种抗流感病毒多肽的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]多肽类药物因其具有类似蛋白和小分子药物双重特性而备受关注，仅2015年多肽药物的销售就占据药物市场的5％，达到500亿美元，并且以每年9
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10％的速度上涨，因此亟待建立高效的低成本的多肽合成和纯化技术。目前，多肽合成主要包括化学法、化学/酶法和生物法。其中，化学方法需要复杂的保护和脱保护过程，需要用到大量的有毒试剂，且可能产生消旋体；化学/生物法通常是用化学方法合成多肽，进一步通过特定的肽连接酶将多个肽段进行连接，工艺相对复杂，连接效率和特异性受到多肽序列的影响；生物法包括采用水解酶水解植物蛋白或动物蛋白然后提取获得特定的有功能的多肽，但是通常产量较低，周期长，污染重，难实现工业化生产。因此，亟需开发一种高效、低毒、可大规模制备多肽的工艺。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在提供一种抗流感病毒多肽的制备方法及应用以解决现有技术中多肽制备步骤复杂、成本高的技术问题。
[0004]为了实现上述目的，一方面，本专利技术采用的技术方案如下：一种抗流感病毒多肽的制备方法，关键在于：
[0005]S1.构建转移载体pQB3s
‑
PIC：将融合表达多肽片段PIC构建到转移质粒pQB3s；所述PIC片段的基因序列为SEQ ID NO 1所示；采用此方案，构建了能够用于IMPACT系统的杆状病毒表达系统转移载体pQB3s
‑
PIC，将融合表达多肽序列的基因片段构建到转移质粒pQB3s,此质粒携带polh强启动子，多克隆位点MCS前融合表达GP64信号肽；
[0006]SEQ ID NO 1基因序列具体为：
[0007][0008][0009]S2.利用杆状病毒Bacmid系统进行融合多肽的高效表达；相比化学合成的方法，采用此方案产量大，成本低，利于制备；
[0010]S3.利用IMPACT系统纯化分泌表达的抗病毒多肽。采用此方案，无需去除蛋白酶和切割buffer，优于常规的标签纯化，能够得到高纯度抗病毒多肽。
[0011]优选的，S1中，摩尔比为1:3的pQB3s和PIC片段通过T4连接酶连接、转化、筛选，得到pQB3s
‑
PIC。
[0012]优选的，S2中pQB3s为经BamHI与XhoI限制性内切酶进行切割回收的pQB3s载体。
[0013]优选的，S2具体为：
[0014]S21.将Sf9昆虫细胞在28℃、无CO2条件下培养至细胞密度达70％
‑
90％；
[0015]S22.将bacmid和pQB3s
‑
PIC质粒混合稀释后，与转染试剂混合均匀，室温静止；
[0016]S23.将S22的混合物与S21的细胞进行转染培育3
‑
5h，更换为新鲜的完全培养液；
[0017]S24.继续在28℃培养约96小时后，收集每孔的培养液，离心分离，获得的上清即为P1代表达重组多肽PIC的杆状病毒，P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代杆状病毒；
[0018]S25.用P2代杆状病毒感染处于对数生长期的悬浮High Five昆虫细胞；
[0019]S26.收集细胞培养液及含有多肽IP
‑
Intein元件
‑
CBD标签的重组蛋白PIC，500xg离心5min并于4℃保存。
[0020]优选的，S3具体为：
[0021]S31.收集感染重组病毒的细胞上清液；
[0022]S32.将细胞上清液通过Chitin亲合柱吸附，后经DTT溶液洗脱、浓缩。具体的，杆状病毒感染后表达的多肽N端融合表达GP64信号肽，C端融合表达Intein元件及CBP标签。GP64信号肽引导多肽进入内质网
‑
高尔基体分泌途径，其通常在完成易位到达ER膜后被内质网中的信号肽酶切除，而后蛋白继续表达分泌。
[0023]分泌到上清中的多肽C末端与内含肽Intein形成融合，经收集后通过Chitin亲合柱吸附，后经DTT溶液洗脱，于4℃诱导内含肽Intein裂解反应，Intein元件在低温条件下进行N端自切割，在几丁质介质上将多肽释放出来，而内含肽Intein与几丁质结合蛋白CBD仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。
[0024]另一方面，本专利技术提供一种抗流感病毒多肽，关键在于：采用如上制备方法制备得到。
[0025]在一方面，本专利技术提供一种生物药物，关键在于：含有如上方法制得的抗流感病毒多肽。
[0026]有益效果：与现有技术相比，本专利技术首次将昆虫杆状病毒表达系统与IMPACT纯化系统结合起来制备抗病毒多肽，通过昆虫杆状病毒表达系统表达多肽，经信号肽分泌到上清中，通过IMPACT系统进行自切割纯化，将高效表达与高效纯化相结合，可以高效生产抗病毒多肽，可抑制流感病毒的cRNA及vRNA合成，具有显著的抑制病毒效果。
附图说明
[0027]图1为转移质粒pQB3s图谱；
[0028]图2为IMPACT系统纯化分泌表达的抗病毒多肽的机理图；
[0029]图3为多肽毒性实验结果图；
[0030]图4为多肽的抗病毒实验结果图；
[0031]图5为多肽的病毒抑制实验结果图。
具体实施方式
[0032]为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作详细说明。
[0033]实施例1构建转移质粒pQB3s
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PIC
[0034](1)合成表达包含抗病毒多肽、Intein元件、CBD标签(Pep
‑
Intein
‑
CBP,PIC)的基因序列，5
’
与3
’
端分别包含BamHI与XhoI限制性内切酶位点；
[0035]合成的表达融合肽段PIC(Peptide
‑
Intein
‑
CBD)的基因序列为：
[0036][0037][0038](2)转移载体pQB3s通过BamHI与XhoI限制性内切酶进行切割，在37℃条件下酶切过夜，然后通过琼脂糖凝胶切胶回收试剂盒回收大片段，40μL的酶切体系如下：
Cell Culture Medium培养液，每孔0.8ml；
[0054](3)取两个洁净无菌离心管，分别加入100μl不含血清和抗生素的Grace'sInsect Cell Culture Medium用于稀释线性化的bacmid和转染试剂。其中一管加入8μg bacmid和8μg pQB3s
‑
PIC质粒，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入8μl LipoInsect
TM
转染试剂，用枪轻轻吹打混匀。稀释的bacmid/pQB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗流感病毒多肽的制备方法，其特征在于：S1.构建转移载体pQB3s
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PIC：将融合表达多肽片段PIC构建到转移质粒pQB3s；所述PIC片段的基因序列为SEQ IDNO 1所示；S2.利用杆状病毒Bacmid系统进行融合多肽的高效表达；S3.利用IMPACT系统纯化分泌表达的抗病毒多肽。2.根据权利要求1所述一种抗流感病毒多肽的制备方法，其特征在于S1中，摩尔比为1:3的pQB3s和PIC片段通过T4连接酶连接、转化、筛选，得到转移载体pQB3s
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PIC。3.根据权利要求1所述一种抗流感病毒多肽的制备方法，其特征在于S2中pQB3s为经BamHI与XhoI限制性内切酶进行切割回收的pQB3s载体。4.根据权利要求1所述一种抗流感病毒多肽的制备方法，其特征在于S2具体为：S21.将Sf9昆虫细胞在28℃、无CO2条件下培养至细胞密度达70％
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90％；S22.将bacmid和pQB3s
‑
PI...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，刘志新，付亚男，曾凤，黄聪聪，
申请(专利权)人：湖北医药学院，
类型：发明
国别省市：