利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体及其应用技术方案

本发明专利技术公开一种利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体及其应用，所述回补载体包括以下构建步骤：(1)扩增PgpdA启动子序列；(2)扩增eGFP序列；(3)融合扩增产物；(4)利用酵母同源重组系统构建中间载体；(5)利用酵母同源重组系统构建回补载体：扩增HYG或NEO抗性基因表达框，将扩增产物与线性化的中间载体共转化进入酵母细胞，构建重组质粒，得到回补载体。本发明专利技术构建的回补载体采用酵母体内重组方法，避免了部分基因的毒性作用，具有更加广谱的应用范围。本发明专利技术回补载体中导入PgpdA启动子，明显提高基因表达量，回补菌株能够表达更加强烈的eGFP荧光信号，更加有利于亚细胞定位观察。利于亚细胞定位观察。利于亚细胞定位观察。

【技术实现步骤摘要】
利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及利用酵母同源重组系统构建香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)，其中4号生理小种(Foc4)是致病力最强的小种，其致病机制和防控措施是香蕉产业重要问题之一。因此，研究Foc4的致病机制是热带地区重要的研究课题之一，主要的手段是采用反向遗传学技术进行基因功能分析。
[0003]丝状真菌的基因敲除和回补技术是研究基因功能的重要技术途径，随着例如Gibson体外重组技术的发展，利用大肠杆菌构建较大的基因组DNA片段构建回补载体成为了可能，但是部分基因自身编码的蛋白可能对宿主菌株产生毒性作用，从而导致非特异性重组等不稳定现象，这是利用体外重组技术面临的重要问题之一。通常采用分段克隆后再连接、调控细菌生长环境降低毒性等方法解决，但这些方法耗时费力且效果不理想。因此，开发其他高效重组技术构建回补载体获得回补转化子是研究丝状真菌基因功能的可行途径之一。
[0004]酵母体内同源重组构建回补转化子是丝状真菌中最常用的方法之一。酵母体内同源重组是一种利用酵母细胞内高效的同源重组系统来实现多个相互存在同源序列DNA片段的组装方法，酵母存在高效的同源重组机制，两个DNA分子之间只要有30
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50bp的同源区间就可以准确、有效的进行同源重组。此外，利用酵母同源重组系统来构建基因回补载体不会受到毒性蛋白的影响，具有快速、稳定、低成本等优点。因此，丝状真菌的基因敲除突变体回补大多采用酵母基因回补载体，比如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)基因敲除突变体最常用的基因回补载体pYF11，利用酵母重组原理将基因回补序列导入回补载体中构建成回补质粒。丝状真菌利用酵母同源重组原理构建回补载体的方式，为利用酵母同源重组原理构建适合香蕉枯萎菌(Foc4)的基因敲除突变体的回补载体提供了理论指导和数据支撑。
[0005]在香蕉枯萎菌(Foc4)中采用禾谷镰刀菌酵母回补载体pYF11进行基因突变体回补的实验中，发现存在几个核心问题影响了pYF11作为Foc4基因回补载体的构建。具体问题如下：
[0006]1)pYF11采用的是博来霉素(Bleomycin)筛选标记，携带博来霉素抗性基因，在筛选基因回补载体抗性的实验中发现，Foc4野生菌株自身对博来霉素无抗性，但是基因敲除突变体携带HYG或NEO抗性基因后对博来霉素产生了一定的交叉抗性，这就妨碍了后续利用博来霉素对回补转化子的筛选和鉴定。
[0007]2)启动子是使目的基因有效表达的重要因子。目前能用于丝状真菌标记的启动子较少，并且枯萎菌遗传转化中启动子对绿色荧光蛋白基因表达的启动作用可能受到菌株生
长阶段的影响，因此找到能使绿色荧光蛋白高效表达并不受Foc4生长期影响的启动子尤为必要。
[0008]3)Foc4敲除的部分功能基因表达量并不高，利用Native启动子，回补转化子中融合的C端eGFP荧光信号太弱，给亚细胞定位带来一定的困扰。

技术实现思路

[0009]鉴于现有技术的不足，本专利技术提供一种利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体的方法及其应用。
[0010]本专利技术方案包括：
[0011]利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体，包括以下构建步骤：
[0012](1)扩增PgpdA启动子序列；
[0013](2)扩增eGFP序列；
[0014](3)融合步骤(2)和步骤(3)的扩增产物；
[0015](4)利用酵母同源重组系统构建pYF11
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PgpdA载体：
[0016]将步骤(3)融合后所得产物与含有博来霉素抗性基因的线性化pYF11载体共转化进入酵母细胞以构建重组质粒，得到pYF11
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PgpdA载体；
[0017](5)利用酵母同源重组系统构建回补载体：
[0018]扩增HYG抗性基因表达框或NEO抗性基因表达框，将扩增产物与线性化的pYF11
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PgpdA载体共转化进入酵母细胞，通过酵母同源重组系统构建重组质粒，得到所述回补载体。
[0019]优选的，步骤(1)包括：在PgpdA启动子的5
′
端导入EcoR I或BamH I酶切位点。
[0020]优选的，步骤(2)包括：在不影响eGFP序列的5
′
端的Xho I位点的同时导入KpnI酶切位点。
[0021]优选的，所述的利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体，其全基因组序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
[0022]本专利技术还提供一种利用所述的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体制备的基因回补突变体，包括以下制备步骤：
[0023]利用引物扩增FCC1基因编码序列，扩增产物与线性化的回补载体共同导入酵母细胞以构建重组质粒，从阳性酵母转化子中提取质粒并将其转移到大肠杆菌菌株中扩繁，测序后获得基因回补质粒；将线性化的基因回补质粒转入FCC1基因敲除突变体的原生质体，通过潮霉素或新霉素筛选获得基因回补突变体。
[0024]另一方面，本专利技术还涉及所述的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体在香蕉枯萎菌基因功能鉴定方面的应用。所述基因为香蕉枯萎菌FCC1基因。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0026]在保留博来霉素抗性基因的基础上，插入HYG、NEO抗性基因，拓宽了筛选标记。利用HYG、NEO抗性基因进行转化子筛选，更加符合香蕉枯萎菌的实际情况。博来霉素抗性基因对HYG、NEO无影响。
[0027]本专利技术构建的回补载体采用酵母体内重组方法，避免了部分基因的毒性作用，具
有更加广谱的应用范围。
[0028]本专利技术回补载体中导入PgpdA启动子，明显提高基因表达量，回补菌株能够表达更加强烈的eGFP荧光信号，更加有利于亚细胞定位观察。
[0029]改造后的回补载体添加了多个酶切位点，克服了pYF11仅用一个Xho I内切酶的问题。
附图说明
[0030]图1：5个菌株在含有不同浓度博来霉素的PSB平板上生长7天后的菌落表型观察。
[0031]图2：不同启动子启动eGFP表达后在分生孢子和菌丝中的荧光表达观察。
[0032]图3：HYG/NEO
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pYF11
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PgpdA回补载体构建流程图。图3
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1、图3
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2、图3
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3为图3的局部放大图。
[0033]图4：pYF11
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PgpdA载体的构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体，其特征在于，包括以下构建步骤：(1)扩增PgpdA启动子序列；(2)扩增eGFP序列；(3)融合步骤(2)和步骤(3)的扩增产物；(4)利用酵母同源重组系统构建pYF11
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PgpdA载体：将步骤(3)融合后所得产物与含有博来霉素抗性基因的线性化pYF11载体共转化进入酵母细胞以构建重组质粒，得到pYF11
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PgpdA载体；(5)利用酵母同源重组系统构建回补载体：扩增HYG抗性基因表达框或NEO抗性基因表达框，将扩增产物与线性化的pYF11
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PgpdA载体共转化进入酵母细胞，通过酵母同源重组系统构建重组质粒，得到所述回补载体。2.根据权利要求1所述的利用酵母同源重组系统构建的香蕉枯萎菌基因敲除突变体回补载体，其特征在于，步骤(1)包括：在PgpdA启动子的5
′
端导入EcoR I或BamH I酶切位点。3.根据权利要求1所述的利用酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，彭军，曾凡云，王艳玮，漆艳香，谢培兰，谢艺贤，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：