一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法技术

本发明专利技术涉及一种医学诊断技术领域，具体涉及一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法。一种慢性乙型肝炎（ＣＨＢ）患者免疫状态的诊断方法，包括下列步骤：收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；检测外周血样品中外周血总ＣＤ８↑［＋］Ｔ细胞的ＰＤ－１；分析外周血样品中外周血总ＣＤ８↑［＋］Ｔ细胞ＰＤ－１单细胞表达强度。本发明专利技术所述的诊断方法具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明专利技术能对临床了解患者免疫状态提供重要信息，进一步能为临床ＣＨＢ抗病毒治疗时治疗方案的确定和调整提供有效的信息，对改善和预测ＣＨＢ治疗疗效具有深远意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医学诊断
，具体涉及一种慢性乙型肝炎患者免疫 状态的诊断方法。
技术介绍
HBV感染引起的乙型病毒性肝炎是一种常见和严重的肝脏疾病.有超过20 亿人曾感染过HBV,至今为止有3. 5亿人仍携带有HBV病毒，其中有1/3在中 国。目前乙型肝炎慢性化的免疫学机制主要包括(l)母婴传播或幼儿期感染形 成的免疫耐受；(2)病毒基因整合于宿主基因组中；(3)病毒发生变异，导致 免疫逃避；(4)病毒感染宿主免疫细胞，导致免疫功能下降。乙型肝炎慢性化 与免疫耐受形成有关，并以机体对HBV的免疫应答低下为特征。免疫清除期 特点是经过多年的免疫耐受期后，病人自身的免疫开始识别乙肝病毒并开 始清除，在清除肝内的乙肝病毒时，免疫反应对肝细胞造成损伤，肝细胞内 的转氨酶释放入血，表现为ALT升高，HBVDNA仍然复制。HBeAg阳性的病人 HBV DNA复制水平仍然较高，而HBeAg阴性的病人HBV DNA水平较低。乙型肝炎病毒感染自然病程中，根据宿主免疫和病毒相互作用可分为免疫 耐受期、免疫清除期和病毒残留期或再复制期三个阶段。在免疫清除期宿主 免疫介导细胞裂解反应被激活，伴随血清HBV DM水平下降和ALT水平升高。宿主免疫反应特别是细胞免疫反应在病毒清除中起重要作用。然而，慢性 乙型肝炎患者(CHB)宿主免疫特点为严重的HBV特异性T细胞功能缺陷，伴随着抗病毒细胞因子分泌水平低下和细胞毒性T细胞活性下降。免疫清除期， 靠慢性乙型肝炎患者(CHB)自身的免疫反应常常达不到将病毒完全抑制或清 除，临床常用干扰素治疗，来加强自身的抗乙肝病毒免疫，起到帮助清除的作用。但是现有的技术缺乏有效的针对慢性乙型肝炎患者(CHB)的免疫状体 有效提示，常产生不必要的免疫激活而造成组织损伤或用药过度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为提供一种新的特异度好的慢性乙型肝炎患者 免疫状态的诊断方法。为此，本专利技术公开了一种慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫状态的诊断方法， 包括下列步骤a) 收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；b) 检测外周血样品中外周血总CD8+T细胞的PD-1;c) 分析外周血样品中外周血总CD8+T细胞PD-l单细胞表达强度(MFI)。 在一些实施方式里，所述慢性乙型肝炎患者为ALT>2倍n.v的乙型肝炎患者。在一些实施方式里，所述步骤b中检测釆用流式细胞检测方法，其中抗体 为荧光标记的抗-CD8抗体和荧光标记的抗-PD-1抗体，二者的荧光标记均不 相同，其中优选抗体为抗-CD8-APC和抗-PD-1-PE抗体。在一些实施方式里，所述分析外周血总CD8+T细胞PD-1单细胞表达强度 (MFI)时，CHB患者的PD-1 MFI与健康人的PD-1 MFI差值愈大，则表明该 C耶患者的免疫状态低下，反之则表明其免疫状态正常。健康人的PD-1 MFI 为3. 64 ±0.76。需要指出的，健康人的PD-1MFI可因人种的不同存在差异，本领域的技术 人员完全可以通过公知常识，来定义各人种的健康人的PD-1 MFI数值范围。本专利技术所述的诊断方法具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少， 同时本专利技术能对临床了解患者免疫状态提供重要信息，进一步能为临床CHB 抗病毒治疗时治疗方案的确定和调整提供有效的信息，对改善和预测CHB治 疗疗效具有深远意义。附图说明图1.免疫清除期CHB和健康对照外周血总T细胞PD-1表达百分比比较。 图2.免疫清除期CHB和健康对照组外周血总T细胞PD-1单细胞表达强度 比较。图3.不同炎症活动CHB外周血总T细胞PD-1 MFI比较。图4.免疫清除期CHB外周血总T细胞PD-1表达同ALT相关关系分析。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说 明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。l.材料和方法1.1病例2007年9月-2008年2月长海医院感染科收治的45例临床诊断 慢性乙型肝炎患者(CHB),均处于免疫清除期(ALT>2倍n.v)。诊断符合 2000年修订《病毒性肝炎防治方案》标准。所有病例排除其它肝炎病毒感染 及合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病等，同时在入组前6个月内未经任何抗 病毒及免疫抑制治疗。另选年龄和性别与病人相匹配的健康献血员(Health) IO例为正常对照组。1.2主要试剂和仪器FITC-CD4流式抗体和APC-CD8流式抗体购自美国 eBiosciences公司,PD-1-PE流式抗体购自美国BD公司。HBV DNA荧光定量 PCR法试剂盒购于深圳匹基生物工程公司；FACSCcalibur流式细胞仪为美国 BD公司。1.3实验方法外周血总t细胞pd-1表达水平的流式检测取50mL抗凝 血，加抗-CD4-FITC、抗-CD8-APC和抗-PD-1-PE流式抗体各5 /a L常温避光孵 育20min标记，用流式细胞裂解液lmL常温避光裂解10min, 1500r常温离心 5min，弃去上清并用PBS lmL冲悬沉淀，1500r常温离心5min洗沉淀1次, 标记处理好后，将细胞收集冲悬在400 nLPBS中，避光放置待上机，上机浓 度为106/mL。激光器波长为488nm和635nm，用Cel lquest (Becton Dickinson5Rutherford, NJ)软件获取和分析数据。抗HAV、抗HCV、抗HDV 、抗HEV、抗EB、抗CMVIgM和HBV病毒学指标用 第三代EUSA法进行检测(SABC公司)。血清HBV DNA水平应用荧光-定量PCR 法检测，操作按深圳匹基生物工程公司生产的HBV DNA荧光定量检测试剂盒 说明书进行。肝功指标在住院期间每周和随访期每月进行检测。2、 统计学处理统计学处理釆用SPSS12. 0软件，数据进行样本均数t检验 和两变量相关性分析。3. 结果3.1病例资料45例慢性乙型肝炎患者，其中男38例，女7例；年龄波动 在16-53 (平均33. 13 ±8. 8)岁，所有病例肝功能指标ALT波动在76-1233 (平均309. 81 ± 290. 75 )IU/L,TBIL波动在5. 30-220. OO(平均30. 71 ±48. 95 ) ,1/L;血清HBVDNA载量水平波动在103-108copiesM (Log 6. 32 土 1. 57); 健康献血员10例。3. 2免疫清除期CHB外周血总T细胞PD-1表达升高应用流式细胞术对免 疫清除期CHB和健康献血员(Health)外周血总T细胞PD-1表达状态进行了 检测。免疫清除期CHB外周血总CD8+T细胞PD-1表达阳性率波动在3. 01%到 47.97%之间,平均为14. 23%±10. 27%;外周血总CD4+T细胞PD-1表达阳性率 波动在4.69%到33. 32%之间，平均为10. 26% ± 4. 77%,明显高于健康对照组(如 图1 )。免疫清除期CHB外周血总CD8+T细胞和CD4+T细胞PD-1单细胞表达强 度(MFI)分别为5. 79 ±2.69与4. 53 ±1.19，健康对照为3, 64 ± 0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法，包括下列步骤：　ａ）收集慢性乙型肝炎患者的外周血样品、抗凝处理；　ｂ）检测外周血样品中外周血总ＣＤ８↑［＋］Ｔ细胞的ＰＤ－１；　ｃ）分析外周血样品中外周血总ＣＤ８↑［＋］Ｔ细胞ＰＤ－１单细胞表达 强度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁雪松，万谟彬，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]