一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法技术

本发明专利技术为一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，其工艺流程包括菌种发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于菌种发酵培养：将双歧杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中３０～４０℃下培养１０～３０小时，１１５℃灭菌１５分钟；再接入大发酵罐３５～４０℃下发酵培养１０～３０小时；１１５℃灭菌１５分钟，发酵液ｐＨ值为５．５～６．５、ＯＤ６００为２．０以上；乳化液真空冷冻干燥：先在－６０～－４０℃预冻１～５小时，后在－６０℃、１～８Ｐａ真空度下真空冷冻干燥１０～３０小时。本发明专利技术方法制备的双歧杆菌冻干菌粉能在－１８℃储存１８个月，其活性和稳定性不受影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开，应用于生物
，为双歧杆菌活菌 制剂产品的开发及其在食品、保健品、医药等方面的应用提供了高效的冻干菌粉制作工艺。
技术介绍
1899年，Tisser首先由母乳营养儿的粪便中分离一种厌氧的革兰阳性杆菌，菌体轻度弯 曲，末端常见分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌是革兰氏阳性多形态杆菌，呈Y字形、V字形、 弯曲状、刮勺状等形态，其典型的特征是有分叉的杆菌，因而取名为bifidus，拉丁语源是裂 开、分开之意。双歧杆菌不形成芽孢，亚甲兰染色菌体着色不规则，无运动性，专性厌氧， 过氧化酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚反应阴性，明胶液化阴性，联苯胺反应阴性；最适生长 温度37 4rC，最适发酵温度35 4(TC，最低生长温度25 28°C，最高生长温度43 45°C; 起始生长pH值为6.7 7.0，在pH值为4.5 5.0以下或pH值为8.0 8.5以上的环境中都不 生长。双歧杆菌对糖类碳水化合物的分解代谢途径不同于乳酸菌的同型或异型发酵，而是经 由特殊的双歧支路，其中果糖-6-磷酸酮酶是其关键性的酶。对葡萄糖代谢是按果糖-6-磷酸 酮酶途径水解，最后生成乙酸和乳酸，二者摩尔比为1.5: 1，不生成C02、 丁酸、丙酸； DNA碱基组成摩尔百分比为57 68。双歧杆菌属于丙酸杆菌科，共有11个种、30个亚种 和型，如分叉双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌等。不 同种类的双歧杆菌对糖的发酵能力不同，产酸不产气。触酶试验多为阳性，多数能分解尿素， 不产生靛基质和硫化氢。无内、外毒素。双歧杆菌一般对卡那霉素、新霉素、链霉素、多粘 菌素、庆大霉素、灭滴灵等耐受。对夹竹桃霉素、林可霉素、万古霉素、青霉素G、氨苄青 霉素、红霉素、呋喃坦啶敏感。在20世纪初，曾试图用双歧杆菌肉汤培养物移植到数量较少的婴儿肠道中，用以提高 婴儿对肠道疾病的抵抗力。20世纪50年代后，多次国际会议讨论双歧杆菌对机体的有益作 用，对其生理意义的认识不断深入，在用于预防和治疗微生态失调及某些疾病中取得了一定 成绩，双歧杆菌引起国际上广泛关注。新出生儿生后数小时，双歧杆菌即可在肠道中定植，此后终生相伴。新生儿胎粪是无菌 的，出生后数小时可检出肠道杆菌、细球菌、链球菌，其数量不断增加，24h大肠杆菌占优 势。出生第2天可检出少量双歧杆菌，但增长十分迅速，第4 5天开始占优势，此时最先 出现的肠道杆菌等数量逐渐下降，于第6 8天则建立了以双歧杆菌占绝对优势的菌群，专性厌氧菌特别是双歧杆菌发酵产生大量醋酸和乳酸，而母乳的缓冲能力较弱，肠道pH迅速 下降，在出生后第7天时母乳营养儿粪便pH为5.1，从而兼性厌氧菌受到抑制。双歧杆菌借 助其表面的磷壁酸牢固粘附于肠黏膜上皮细胞，并在那里定植增殖。肠道正常微生物群是一组庞大的生态组织，种群超过400种，其中数量较多的双歧杆菌 属革兰阳性厌氧无芽孢杆菌，是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一，参与免疫、营养、 消化和保护等一系列生理过程。双歧杆菌具有多种生理功能，是目前公认的益生菌。有关双歧杆菌能提高人体肠道抗病 力这方面的生理功能有不少的研究和报道，双歧杆菌对腐败菌及病原菌、病原性埃希氏大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、变形菌、白假丝酵母等具有抑制作 用。双歧杆菌不仅产生各种维生素如VB1、 VB2、 VB6、 VB12、烟酸和叶酸等以供人体所 需，还能通过抑制某些维生素分解菌来保障维生素的供应。双歧杆菌可促进肠管蠕动，又由 于双歧杆菌产生的有机酸可使肠管内渗透压增高，水分分泌亢进，粪便中水分增高而缓解便 秘。双歧杆菌还能在肠道内可吸收利用一些肠道内腐生菌产生的大量吲哚、硫化氢、胺等有 害代谢产物，抑制产胺的腐败菌，降低肠道内的pH值，使氨变为难于吸收的离子型，达到 降低血氨和保护肝功能的功效。双歧杆菌在肠道内通过诱导免疫原反应增强人体免疫机 能。双歧杆菌通过抑制腐生菌的生长和分解致癌物质而起到预防肠道癌和肠道肿瘤的作用。双歧杆菌制品是利用宿主自身的优势生理细菌-双歧杆菌作发酵剂，通过工业化发酵扩 大生产制成活菌制剂，再回归宿主原来的生境，达到调节或维持机体正常生理状态的制品。 目前国内外市场上有关双歧杆菌的商品根据其机能可分为双歧杆菌食品、含有双歧杆菌及其 生长促进物质的特定保健性食品、双歧杆菌药品。根据所使用的菌种数的不同，又可以分为 单菌株制剂和联菌株制剂。我国《益生菌类保健食品申报与评审规定(试行)》列出了可用 于保健食品的益生菌菌种名单(2005年7月1日实施)，g卩两岐双岐杆菌Bifidobacterium bifidum;婴儿双岐杆菌Bifidobacterium infantis;长双岐杆菌Bifidobacterium longum;短双 岐杆菌Bifidobacterium breve;青春双岐杆菌Bifidobacterium adolescentis;德氏乳杆菌保加 禾lj亚禾中Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus; 嗜酸学L杆菌Lactobacillus acidophilus; 干 酪享L杆菌干酪亚禾中Lactobacillus casei subsp. Casei;嗜热链球菌Streptococcus thermophilus; 罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri。其中两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双 歧杆菌、青春双歧杆菌均属于双歧杆菌。其中婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌只在婴儿的肠道内 存在并占优势，随着人的年龄增高则逐渐减少和消失；成人的肠道内则以青春双歧和长双歧 为主，由于长双歧所带有的葡萄糖苷酶存在一定的异议，因而应用较少。而青春双歧杆菌的 免疫激活的活性优于其它双歧杆菌，应用变得越来越广泛。20世纪60年代后，我国开始了这一领域的研究，试图利用双歧杆菌等微生态制活菌制 剂达到有病治病、未病防病、无病保健三重效应，展现出了可喜前景。国内有许多企业利用 双歧杆菌冻干粉为原料生产生物制品，作为药品主要控制其单位活菌数量，活菌数量直接影 响药品的功能。因此，在冻干粉生产过程中提高活菌数量尤为重要。活菌制剂在消费之前应 当维持较高的活菌水平，而当前的许多产品都不能有效地防止活菌数的衰减。如何筛选菌种 适应在扩增培养工艺操作中，优化发酵的过程中影响活菌数量质量如发酵温度、培养pH值 和培养基中双歧因子等主要因素是非常重要的。另外，利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂 是多种保藏方法中较为理想的一种，但冷冻和干燥过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡 及某些酶蛋白分子的钝化，而且如果冻干工艺中保护剂选择不当，则发酵活力随之下降。所 以，要获得足够存活的数量和质量活菌并延长活菌保藏期，以便充分发挥其生理功能，并降 低成本，已成为双歧杆菌活菌制剂产品研究开发及其应用的技术关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开，是一种高密度高稳定性高活性 冻干菌粉的制备方法，通过30 40°C10 30小时高密度培养使发酵液菌体浓度达 1.0xl08cfu/g，通过高效发酵液分离技术使菌泥浓度达1.0xl09cfu/g，通过高活性乳化及真空 冷冻干燥等优化工艺后，得到1.0x本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法，其工艺流程包括菌种发酵培养、发酵液分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥，其特征在于：所述菌种发酵培养工艺：将双歧杆菌菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，在３０～４０℃下培养１０～３０小时，再接入大发酵罐进行发酵培养，３５～４０℃培养１０～３０小时；所述培养基的重量百分比组成为：双歧因子１～５％、葡萄糖１～２％、蛋白胨０．５～２％、酵母膏０．５～２％、柠檬酸二铵０．１～０．２％、磷酸氢二钾０．１～０．２％、无水乙酸钠０．１～１％、硫酸镁０．０５～０．１％、吐温－８００．０００１％、其余为水，１１５℃灭菌１５分钟，并以补加氢氧化钠溶液控制培养酸度使发酵液ｐＨ值为５．５～６．５；所述菌泥乳化工艺，按照活菌菌泥∶菌泥保护剂＝０．１∶１～１∶０．１的比例将菌泥与保护剂混合乳化，菌泥保护剂配方各组份重量百分比为：脱脂奶粉１～１０％、乳糖１～１０％、玉米淀粉１～１０％、抗氧化剂０．１～１％、吐温－８０　０．０１～０．０５％，其余为水，菌泥保护剂在１０５℃～１１５℃条件下灭菌１５分钟后冷却至５～２０℃备用；所述的抗氧化剂在异维生素 Ｃ、谷氨酸和甘氨酸中选择一种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方曙光，
申请(专利权)人：上海谱莱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]