一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，属于药物分析领域。本发明专利技术采用重组C因子法定量检测重组新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，通过选用Tris缓冲液作为稀释剂，相比细菌内毒素检测水作为稀释剂，大大减少了稀释倍数；另外，因受疫苗中铝佐剂的干扰，该方法采用欧洲药典提到的特异性结合的方法，即在微孔板中提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白来对内毒素进行特异性结合，之后通过ELISA的步骤去除干扰成分，实现了定量检测新型冠状病毒疫苗内毒素，并且具有特异性强、灵敏度高，以及更准确更环保的优势。以及更准确更环保的优势。以及更准确更环保的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法


[0001]本专利技术涉及药物分析领域，特别是涉及一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法。

技术介绍

[0002]重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)现行检验标准为鲎试剂检查法，给出的结果是阴或是阳，无法准确知道其中内毒素含量。另外，鲎被列为国家二级保护动物，2019年3月世界自然保护联盟(IUCN)正式宣布中华鲎“濒危”。意味着内毒素检测试剂原料将受到严格管控。因此寻求替代测试方法迫在眉睫。
[0003]C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组C因子是人工合成的C因子，它被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。重组C因子(Recombinant Factor C，rFC)法系依据内毒素浓度和其孵育终止时的荧光值之间的量化关系来测定内毒素含量。而目前，重组C因子法在鲎资源保护方面起到重要作用，但因为其试剂盒价格高，技术虽成熟但在未得到普遍应用，国内对其应用研究的少，对疫苗等内毒素检测鲜有报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法采用重组C因子法(rfc法)定量检测重组新型冠状病毒疫苗内毒素含量，相比现有利用鲎试剂检测内毒素的方法，特异性强、灵敏度高，且更准确更环保。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，包括以下步骤：
[0007](1)用Tris缓冲液稀释工作标准品CSE至少四个浓度，建立标准曲线；
[0008](2)用Tris缓冲液稀释新型冠状病毒疫苗后加入微孔板，再加入反应混合液，37℃孵育，在0h和1h时在酶标仪读数；其中，所述反应混合液包括缓冲液、荧光底物和重组C因子；
[0009](3)根据步骤(2)读出的数据，利用所建立的标准曲线计算出新型冠状病毒疫苗中细菌毒素的含量。
[0010]优选的是，所述方法还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为含5.0EU/mL的内毒素标准品。
[0011]优选的是，所述工作标准品的稀释浓度分别为50EU/mL、5EU/mL、0.5EU/mL以及0.05EU/mL。
[0012]优选的是，所述新型冠状病毒疫苗的稀释倍数为50
‑
200倍。
[0013]优选的是，所述新型冠状病毒疫苗和所述反应混合液的体积比为1∶1。
[0014]优选的是，所述反应混合液中缓冲液、荧光底物和重组C因子的体积比为8∶1∶1。
[0015]本专利技术公开了以下技术效果：
[0016]本专利技术采用重组C因子法定量检测重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)内毒素的方法，该方法通过选用Tris缓冲液作为稀释剂，比细菌内毒素检测用水所需要的稀释倍数要少20倍(一般用重组C因子试剂盒检测细菌内毒素时，使用细菌内毒素检查用水需稀释1000倍)；另外，因受疫苗中铝佐剂的干扰，本专利技术在微孔板中提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白来对内毒素进行特异性结合，之后通过ELISA的步骤去除干扰成分，可以实现特异性、高灵敏度的检测新型冠状病毒疫苗内毒素的目的。
[0017]本专利技术的方法实现了定量检测实际内毒素含量的目的，在确定了内毒素限值和稀释倍数后，可直接对待测供试品进行检测，无需再次进行试验来确定稀释倍数，作为鲎试剂的重组替代品，从生产工艺来说应比自然提取的鲎试剂生物变异更小，批间一致性更高，有利于检测方法的标准化，并且保护鲎资源。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为本专利技术利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素时微孔板布局示意图；
[0020]图2为本专利技术利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的原理图。
具体实施方式
[0021]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0022]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0023]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0024]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本专利技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0025]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即
意指包含但不限于。
[0026]实施例1
[0027](1)仪器的增益调节
[0028]调节增益值：Tris缓冲液将配套的工作标准品(CSE)溶解，置混旋仪上1400rpm充分混合10min以上，标的浓度为500EU/mL。然后用Tris缓冲液稀释10倍、100倍(每步骤1min以上)，将5EU/mL的标准品液100μL加入微孔板上右下角的6个孔(F11
‑
H12)，移去其他可拼拆的测试孔部分。置入酶标仪中，将微孔板(该微孔板提前固相包被加入重组的噬菌体尾丝蛋白，来自法国Hyglos GmbH公司试剂盒，货号609033)预热至37℃，并按比例配制反应混合液(560μL缓冲液∶70μL荧光底物∶70μL重组C因子，三种试剂均购自法国Hyglos GmbH公司，货号609033)，向每孔中添加100μL。完成读数，并记录最优增益值。
[0029]增益值调节结果见表1。
[0030]表1调节增益值结果
[0031][0032](2)标准曲线的建立
[0033]将已经溶解并充分混合的工作标准品(CSE)，用Tris缓冲液连续稀释至标的值50EU/mL、5EU/mL、0.5EU/mL、0.05EU/mL，按图1将每个稀释度的2个重复加入微孔板左上角的8个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用重组C因子法检测新型冠状病毒疫苗内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用Tris缓冲液稀释工作标准品CSE至少四个浓度，建立标准曲线；(2)用Tris缓冲液稀释新型冠状病毒疫苗后加入微孔板，再加入反应混合液，37℃孵育，在0h和1h时在酶标仪读数；其中，所述反应混合液包括缓冲液、荧光底物和重组C因子；(3)根据步骤(2)读出的数据，利用所建立的标准曲线计算出新型冠状病毒疫苗中细菌毒素的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘骅，丁震，孙备，阚家义，许雷鸣，方芳，
申请(专利权)人：安徽省食品药品检验研究院安徽国家农副加工食品质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：