一种以对香豆酸为底物合成白藜芦醇的工程菌株、构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以对香豆酸为底物合成白藜芦醇的工程菌株、构建及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术对4

【技术实现步骤摘要】
一种以对香豆酸为底物合成白藜芦醇的工程菌株、构建及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种以对香豆酸为底物合成白藜芦醇的工程菌株、构建及其应用。

技术介绍

[0002]白藜芦醇，又名芪三酚，是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素，可在葡萄叶及葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的生物活性成分。口服容易吸收，代谢后通过尿液及粪便排出。白藜芦醇一种植物次级代谢产物，白藜芦醇已被证明在抗氧化、抗炎、抗癌、雌激素、神经保护、心脏保护、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗糖尿病、抗骨质疏松和减肥中的调节作用，备受人们的青睐，在医药、保健品、化妆品等方面有着广阔的应用前景。尤其是近年来在临床上对细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞均有显著抑制作用，所以成为人们研究的热点。目前单纯依靠天然植物提取白藜芦醇的方法已经无法满足人们的需要，化学合成法又因为污染严重和安全性受质疑而推广困难，随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步，在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主中设计与构建高效的异源合成途径，结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇等植物源珍稀天然产物工业化生产的重要方法。然而，目前的工程菌株，无论是以简单碳源为底物从头合成还是以前体喂养方式，白藜芦醇产量都较低，并不适合工业化生产。
[0003]本专利技术提供了一种4
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香豆酰基辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体，及基于这两个突变体构建高产白藜芦醇的解脂耶氏酵母工程菌株，其催化对香豆酸生成白藜芦醇转化率达到92.3％，产量高达35.8g/L，为大规模工业化生产白藜芦醇提供了支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术的不足，提供一种以对香豆酸为底物高效合成白藜芦醇的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用，其能够用于以对香豆酸为底物高效合成白藜芦醇。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体，和一种白藜芦醇合酶突变体。4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体可用于以对香豆酸为底物高效合成白藜芦醇。
[0007]本专利技术提供的4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体，其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：260位、328位、330位、333位、338位、351位、353位、363位、364位、378位、381位、442位、451位、452位、453位、457位、460位、492位、498位，即这些位点中的一个或多个突变为除原本氨基酸外的其他氨基酸中的任意一种；
[0008]优选地，4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体中各位点的突变方式分别为：Y260F、S328V、A330S、L333M、E338R、G351S、G353C、L363A、A364S、S378P、C381V、I442V、L451F、F452D、
I453V、L457M、L460M、K492P、E498Q。
[0009]本专利技术提供的白藜芦醇合酶突变体，其氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：51位、54位、57位、59位、61位、62位、203位、204位、205位、208位、252位、254位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、273位、276位、307位、312位、313位、315位。
[0010]优选地，白藜芦醇合酶突变体中各位点的突变方式为：E51D、K54E、N57K、I59M、D61Q、K62S、E203Q、D204T、A205H、S208C、G252C、I254V、F265C、H266D、L267M、W268L、P269K、N270D、T273G、S276D、P307H、A312Q、V313I、A315S。
[0011]本专利技术中的4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体可通过质粒扩增诱变的方法获得。
[0012]本专利技术中还提供4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体的编码基因。本专利技术中的编码基因可插入重组表达载体或基因组。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其他载体。本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体”编码基因的表达载体，如酶切酶连、无缝克隆法。
[0013]上述编码基因以及表达载体可以用于转化宿主细胞，以使其能够表达4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体蛋白质。本专利技术所述的宿主细胞包括包含上述表达载体或基因组上整合了本专利技术4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体的编码序列的宿主细胞。本专利技术的宿主细胞或菌株能够高效表达具有高催化性能的4
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香豆酰辅酶A连接酶和/或白藜芦醇合酶突变体酶。
[0014]本专利技术的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。所述宿主细胞具体可为细菌或酵母菌；优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；更优选地，所述宿主细胞是解脂耶氏酵母。
[0015]第二方面，本专利技术提供一种上述4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的编码基因和白藜芦醇合酶突变体的编码基因。上述4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体、白藜芦醇合酶突变体的编码基因可进一步经密码子优化。
[0016]第三方面，本专利技术提供一种包括上述4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的编码基因的表达载体和上述白藜芦醇合酶突变体的编码基因的表达载体。
[0017]第四方面，本专利技术提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌中包含4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的编码基因的表达载体和/或白藜芦醇合酶突变体的编码基因的表达载体，或其基因组中整合有4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的编码基因和/或白藜芦醇合酶突变体的编码基因，两基因可单独表达，也可通过融合表达构建为融合蛋白。
[0018]优选地，所述的重组基因工程菌为融合表达了上述4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体和白藜芦醇合酶突变体的高产白藜芦醇的解脂耶氏酵母工程菌。
[0019]第五方面，本专利技术提供重组基因工程菌的获得方法：将上述表达载体转入宿主细胞中获取。在重组基因工程菌中包含4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的编码基因和白藜芦醇合酶突变体的编码基因两者时，两基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体，其特征在于：所述的4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体的氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变得到：260位、328位、330位、333位、338位、351位、353位、363位、364位、378位、381位、442位、451位、452位、453位、457位、460位、492位、498位。2.根据权利要求1所述的4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体，其特征在于：4
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香豆酰辅酶A连接酶突变体中各氨基酸残基位点的突变方式分别为：Y260F、S328V、A330S、L333M、E338R、G351S、G353C、L363A、A364S、S378P、C381V、I442V、L451F、F452D、I453V、L457M、L460M、K492P、E498Q。3.白藜芦醇合酶突变体，其特征在于：所述白藜芦醇合酶突变体的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示序列在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变得到：51位、54位、57位、59位、61位、62位、203位、204位、205位、208位、252位、254位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、273位、276位、307位、312位、313位、315位。4.根据权利要求3所述的白藜芦醇合酶突变体，其特征在于：白藜芦醇合酶突变体中各氨基酸残基位点的突变方式分别为：E51D、K54E、N57K、I59M、D61Q、K62S...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴元庆，杨志彬，冯斌，李迪，胡江林，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：