多靶点检测HIV-1的crRNA、CRISPR-Cas12a系统和检测方法技术方案

本发明专利技术公开了检测HIV

【技术实现步骤摘要】
多靶点检测HIV
‑
1的crRNA、CRISPR
‑
Cas12a系统和检测方法


[0001]本专利技术涉及艾滋病的检测领域。更具体地，本专利技术涉及扩增HIV
‑
1核酸的重组酶介导扩增用引物组、多靶点检测HIV
‑
1核酸的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA、CRISPR
‑
cas12a系统、以及HIV
‑
1RT
‑
RAA/CRISPR检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的慢性传染性疾病。终结艾滋病流行的一个关键环节在于检测发现HIV感染者，既往研究发现，未被诊断发现的HIV感染者，特别是急性期感染者是导致HIV感染传播的重要原因。及早发现感染者并在感染早期进行抗病毒治疗可以有效提高抗病毒治疗效果，并通过抑制病毒在体内复制有效降低传播风险。因此，尽早诊断HIV感染对于预防HIV传播具有重要的公共卫生意义。
[0003]迄今为止，全球流行的HIV可以分为两种基因型，HIV
‑
1和HIV
‑
2。HIV
‑
1广泛分布于世界各地，是引起全世界艾滋病流行的主要病原体。HIV
‑
1型可进一步分为M、N、O、P组，其中M组毒株是导致全球艾滋病流行的主要病毒株，至少包括A、B、C、D、F、G、H、J、K和L 10个不同的亚型以及多种流行重组型(circulating recombinant form，CRF)和独特重组型(unique recombinant form，URF)。我国以HIV
‑
1为主要流行株，主要亚型包括CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B等，近年来不断发现新的流行重组型(例如CRF55_01B、CRF85_BC等)和独特重组型(例如0107、01B、01BC、01C等)，不同HIV
‑
1亚型间的基因序列多样性可能导致检测试剂出现漏检的情况发生。
[0004]现基于不同的技术已经有多种商品化HIV
‑
1核酸检测试剂盒，例如逆转录PCR技术(Reverse transcriptase
‑
polymerase chain reaction，RT
‑
PCR)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence
‑
based amplification，NASBA)技术、分枝DNA(branched DNA signal amplification，bDNA)技术、实时荧光PCR定量技术(Quantitative real
‑
time PCR，qPCR)等，但这些检测试剂通常实验操作流程较复杂、依赖于变温设备、成本较高，并且检测时间通常需要3个小时以上，这些因素使得HIV
‑
1核酸检测通常在大型医院或实验室中开展，限制了HIV
‑
1核酸检测在资源有限的基层医疗机构推广应用。
[0005]因此，本领域需要一种亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、检测时间短的HIV
‑
1核酸检测方法。

技术实现思路

[0006]为了解决现有检测方法所存在的缺陷，本专利技术人经过反复研究，提出了一种将逆转录
‑
重组酶介导扩增(Reverse transcription recombinase aided amplification，RT
‑
RAA)与CRISPR
‑
Cas12a检测系统相结合的多靶点检测HIV
‑
1的方法—HIV
‑
1RT
‑
RAA/CRISPR。本专利技术的检测方法兼具了亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、检测时间短等特点。由此，得到本专利技术。
[0007]因此，在第一方面，提供了一种用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA，所述crRNA从5
’
端到3
’
端依次为重复序列和靶向特异性序列，其中所述靶向特异性序列包含选自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的核酸序列：
[0008]SEQ ID NO.25：GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；
[0009]SEQ ID NO.26：UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；
[0010]SEQ ID NO.27：CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC。
[0011]在第二方面，提供了一种用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a系统，包括：Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的一个、两个或三个。
[0012]在第三方面，提供了第一方面的用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA或第二方面的CRISPR
‑
Cas12a系统用于制备艾滋病诊断试剂的用途。
[0013]在第四方面，提供了一种检测HIV
‑
1的方法，包括以下步骤：
[0014](1)提供HIV
‑
1核酸样本；
[0015](2)配制CRISPR
‑
Cas12a检测混合液，包括：
[0016]a)Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的一个、两个或者三个，或者
[0017]b)第二方面的用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a系统；
[0018](3)对所述HIV
‑
1核酸样本进行扩增反应，得到扩增产物；
[0019](4)使所述扩增产物与所述CRISPR
‑
Cas12a检测混合液混合并反应，并通过荧光淬灭报告分子的荧光发光情况来确定是否存在HIV
‑
1。
[0020]在第五方面，提供了一种用于检测HIV
‑
1的试剂盒，包括：
[0021]a)第一方面的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA和Cas12a蛋白，或第二方面的CRISPR
‑
Cas12a系统；
[0022]b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书；以及
[0023]c)任选地，用于扩增HIV
‑
1核酸的引物组：
[0024]上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA，所述crRNA从5
’
端到3
’
端依次为重复序列和靶向特异性序列，其中所述靶向特异性序列包含选自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的核酸序列：SEQ ID NO.25：GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；SEQ ID NO.26：UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；SEQ ID NO.27：CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC；优选地，所述重复序列为SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29所示的序列；更优选地，所述crRNA是SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SE Q ID NO.24所示的crRNA：SEQ ID NO.22：AAUUUCUACUCUUGUAGAUGGGUUUAUUA CAGRGACARCAGAGA；SEQ ID NO.23：AAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUGUCUGUU GCUAUUAURUC；SEQ ID NO.24：AAUUUCUACUCUUGUAGAUCCCUGCACUGU ACCCCCCAAUCC。2.一种用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a系统，包括：1)Cas12a蛋白，例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，以及2)权利要求1所述的crRNA中的一个、两个或三个，优选为三个。3.权利要求1所述的CRISPR
‑
Cas12a用crRNA或权利要求2所述的用于检测HIV
‑
1的CRISPR
‑
Cas12a系统用于制备艾滋病诊断试剂的用途；优选地，所述crRNA或所述CRISPR
‑
Cas12a系统中包含的crRNA为等比存在的三个crRNA，优选等比存在的SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的crRNA。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述crRNA或CRISPR
‑
Cas12a系统还与用于扩增HIV
‑
1核酸的引物组联合用于制备艾滋病诊断试剂，所述引物组包括：上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；优选地，所述扩增是重组酶介导扩增反应；任选地，所述crRNA或CRISPR/Cas12a系统进一步与荧光淬灭报告分子联合用于制备艾滋病诊断剂；例如，所述荧光淬灭报告分子是5
’
端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3
’
端经由荧光淬灭基团如IowaFQ quencher标记的单链DNA。5.一种检测HIV
‑
1的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：(1)提供HIV
‑
1核酸样本；(2)配制CRISPR
‑
Cas12a检测混合液，包括：a)Cas12a蛋白，例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，以及权利要求1所述的crR...

【专利技术属性】
技术研发人员：金聪，张鑫，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：