一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性木聚糖酶基因XynWL6为新的木聚糖酶基因。XynWL6酶的分子量约为50kDa，酶反应的最适pH为pH8.0，最适温度为50℃。该酶在pH10.0条件下温育处理60min条件下酶活能保持80％以上，同时在60℃条件下保温60min后酶活能保持在60％左右。并且该酶还具有耐多种金属离子、耐表面活性剂和耐金属离子螯合剂等优良特性。可见，该酶符合造纸等工业用酶的基本要求，具有非常良好的应用前景。具有非常良好的应用前景。具有非常良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]木聚糖是自然界中含量最丰富的半纤维素，几乎在所有植物组织中都有发现，它是一种主要存在于植物细胞的细胞壁中的复杂分子。该聚合物的主链由β
‑
1,4糖苷键连接的D
‑
吡喃木糖残基组成。侧链连接有各种短的基团，侧链上的取代基以L
‑
Arabinose、FerulcAcid、AcetyL、Coumaricacid和Glcuronicacid的残基形式存在，因此不同木聚糖的结构和化学组成差异很大。由于其结构的复杂性，想要将其完全转化为单糖，需要多种具有不同功能和作用方式的水解酶协同作用才能完成。
[0003]木聚糖酶是指能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶的总称，包括内切β1,4
‑
D
‑
木聚糖酶(endo
‑
1,4
‑
β
‑
D
‑
xylnxylnohydrolse，EC.3.2.1.8)、β
‑
D
‑
木糖苷酶(β
‑
xylnxylhydrolse，EC.3.2.1.37)、α
‑
L阿拉伯糖苷酶(α
‑
arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)、α
‑
D
‑
葡糖苷酸酶(α<br/>‑
glcuronidase，EC3.2.1.139)、乙酰基木聚糖酶(α
‑
glcuronidase，EC3.2.1.139)等。狭义上的木聚糖酶单指内切β
‑
1,4
‑
D木聚糖酶，它能够催化木聚糖的主链内β
‑
1,4
‑
糖苷键的水解，切割木聚糖主链的β
‑
1,4
‑
糖苷键，生成木寡糖或带有侧链的寡聚木糖，从而降低木聚糖的聚合度，将木聚糖水解成低聚木糖，因此，内切木聚糖酶也称作木聚糖水解的关键酶。
[0004]工业上利用木聚糖酶还存在一些问题:稳定性低、底物特异性差，酶活性范围窄，限制了木聚糖酶的广泛应用，大多数报道的GH10木聚糖酶不能耐受超过50℃的温度。研究嗜极微生物已被证明是发现稳定性更高的新型酶的有效策略，同时，为使筛选得到的木聚糖酶能进行大规模生产，通常需要利用基因工程的手段实现木聚糖酶的异常源表达，探索更加有效的表达系统最终实现大规模发酵生产，以满足工业应用的要求。此外，借助高通量设备，计算机软件辅助的方式，从分子进化角度深度探索酶结构与功能的关系，也是近年来的研究热点之一。理性设计和定向进化方法已被广泛用于改善木聚糖酶的性能，国内外的相关研究也已取得重要研究进展。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种碱性木聚糖酶XynWL6基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本专利技术根据木聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性木聚糖酶的酶基因。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述XynWL6基因的表达载体。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供含有上述XynWL6基因的大肠杆菌菌株。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶XynWL6的应用。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010]一种碱性木聚糖酶XynWL6基因，所述XynWL6基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所
示。
[0011]所述碱性木聚糖酶XynWL6基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TGA结束，共包括1443个核苷酸。
[0012]上述碱性木聚糖酶XynWL6基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
[0013]碱性木聚糖酶XynWL6基因开放阅读框编码479个氨基酸。
[0014]一种含有本专利技术XynWL6基因的表达载体。
[0015]所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
[0016]本专利技术的XynWL6基因被插入至pET
‑
28a(+)载体中。
[0017]本专利技术的XynWL6基因被插入至pET
‑
28a(+)载体中的NdeI和Xho I酶切位点之间；
[0018]含有本专利技术的XynWL6基因的大肠杆菌菌株。
[0019]所述的大肠杆菌菌株含有本专利技术的表达载体。
[0020]一株表达碱性木聚糖酶XynWL6的菌株，是将上述核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21 Star(DE3)得到。
[0021]一株表达碱性木聚糖酶XynWL6的菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0022]用PCR方法从Isoptericola sp.WL6的基因组DNA中克隆出酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET
‑
28a(+)中，得到重组质粒pET
‑
28a
‑
XynWL6，并转化大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶XynWL6的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)
‑
XynWL6；
[0023]所述的PCR的所用的引物的序列：
[0024]上游引物F2：5
′‑
gtgccgcgcggcagcCATATGCGTCCGCACCCGGAA
‑3′
；(下划线的序列表示的是NdeI酶切位点)
[0025]下游引物R2：5
′‑
gtggtggtggtggtgCTGGAGTCAACCGGTGGTACACGGG
‑3′
；(下划线的序列表示的是Xho I酶切位点)
[0026]所述的碱性木聚糖酶XynWL6在造纸、洗涤等工业中的应用。
[0027]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0028](1)根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性木聚糖酶基因XynWL6为新的木聚糖酶基因。
[0029](2)通过his标签进行亲和层析分离纯化得到Isoptericola sp.WL6重组木聚糖酶蛋白，该重组酶分子量约为50kDa，酶反应的最适pH为pH8.0，最适温度为50℃。该酶在pH10.0条件下温育处理60min和60℃条件下保温60min后酶活均能保持80％以上，并且该酶还具有耐多种金属离子、耐表面活性剂和耐金属离子螯合剂等优良特性。可见，该酶符合造本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱性木聚糖酶XynWL6，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。2.编码权利要求1所述的碱性木聚糖酶XynWL6的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。4.一种含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2或3所述的基因被插入至pET
‑
28a(+)载体中。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘森林，张文斌，陈伟钊，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：