检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对、探针、试剂盒，还提供了检测方法，提取含有苹果坏死花叶病毒的待测样品的总RNA，逆转录得到模板cDNA；用ddPCR引物对和探针对模板cDNA进行ddPCR反应，进行结果判定。本发明专利技术将利用ddPCR检测苹果坏死花叶病毒的引物对与探针结合使用，得到检测苹果坏死花叶病毒的引物组，检测结果可直接判读，并具有高灵敏度、高精确度等优点。高精确度等优点。高精确度等优点。

【技术实现步骤摘要】
检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对、探针、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于苹果坏死花叶病毒的检测
，具体涉及一种检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对、探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]苹果花叶病是最为严重的苹果病毒病害之一，广泛分布于世界各地，在我国也普遍发生，病株率高。苹果花叶病的主要症状包括斑驳型、花叶型、网斑型、云斑型、环斑型、镶边型及以上症状的混合类型，枝条和果实则没有明显的症状表现。
[0003](apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果花叶病的主要病原。ApNMV为单链正义RNA病毒，属于雀麦花叶病毒科(bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)第三亚组(subgroup3)，其基因组结构为三分体，包括RNA1、RNA2和RNA3。该病毒与苹果花叶病毒(apple mosaic virus,ApMV)和李属坏死坏斑病毒(prunus necrotic ring spot virus,PNRSV)同源性较高，其在我国苹果花叶样品中的检出率高达92.1％，严重威胁我国苹果产量和品质的提升。ApNMV通过嫁接传播，未发现昆虫传播介体，田间不能摩擦接种传播。
[0004]ApNMV常用的检测方法是基于血清学的酶联免疫方法和基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的分子检测方法。血清学方法检测植物病毒病具有直观、方便等特点，但在灵敏度方面依赖于抗血清的品质，检测耗费时间久，而且目前尚无商品化抗体。PCR技术由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用尤为广泛。PCR技术不需要抗体制备，但无法实现检测结果的准确定量。由于ApNMV在脱毒苗中的丰度较低，血清学和PCR方法容易造成阳性材料漏检，导致检测结果失真。
[0005]微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是第3代PCR技术，是一种基于泊松分布(Poisson distribution)进行绝对定量的新型核酸检测技术。由于ddPCR不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct值)，也不需要设置内参基因和建立标准曲线，通过极限稀释分析和泊松分布分析即可直接检测样品中靶标基因的绝对拷贝数，具有高灵敏度、高精确度、高耐受性、绝对定量以及对扩增抑制物耐受性好等优点(Hindson et al.,2011)，非常适合于低丰度核酸检测(禹思宇等,2016)。目前，ddPCR已经应用于低丰度核酸检测、拷贝数变异分析(Qin et al.,2008)和转基因作物成分检测(姜羽等,2014；胡佳莹等,2016；于晓帆等,2016)等研究领域中；但在病毒样品检测中的应用还相对较少。目前，未见利用ddPCR方法对ApNMV进行检测的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对、探针、试剂盒及检测方法，该方法将利用ddPCR检测苹果坏死花叶病毒的引物对与探针结合使用，得到检测苹果坏死花叶病毒的引物组，检测结果可直接判读，并具有高灵敏度、高精确度、高耐受性、绝对定量以及对扩增抑制物耐受性好等优点。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对，所述ddPCR引物对包括上游引物ApN
‑
ddF3和下游引物ApN
‑
ddR3；所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0008]本专利技术还提供了一种检测苹果坏死花叶病毒的探针，所述探针包括探针ApN
‑
pb3；
[0009]所述探针ApN
‑
pb3的5
’
端添加Cy5抗原标记，3
’
端添加BHQ
‑
3抗原标记；
[0010]所述探针ApN
‑
pb3与ddPCR引物对相匹配；
[0011]所述ddPCR引物对包括上游引物ApN
‑
ddF3和下游引物ApN
‑
ddR3；所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0012]所述探针ApN
‑
pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0013]本专利技术还提供了一种检测苹果坏死花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒包括ddPCR引物对及其对应的探针ApN
‑
pb3、反应缓冲液和阳性对照；
[0014]所述ddPCR引物对包括上游引物ApN
‑
ddF3和下游引物ApN
‑
ddR3；所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述探针ApN
‑
pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0015]本专利技术还提供了一种检测苹果坏死花叶病毒的方法，其特征在于，该方法为：
[0016]S1、提取含有苹果坏死花叶病毒的待测样品的总RNA，逆转录得到模板cDNA；
[0017]S2、用ddPCR引物对和探针ApN
‑
pb3对S1中得到的模板cDNA进行ddPCR反应，进行结果判定；
[0018]在总微滴数＞20000的基础上，根据阳性微滴样点数多少判定结果，
[0019]判定标准为：
[0020]当微滴样点数≥2时，判定为阳性样品；
[0021]当微滴样点数＜2时，判定为阴性样品；
[0022]所述ddPCR反应的体系为：cDNA模板2μL、10μmol/L的上游引物ApN
‑
ddF30.8μL～3.2μL、10μmol/L的下游引物ApN
‑
ddR30.8μL～3.6μL、10μmol/L的探针ApN
‑
pb30.4μL～1.8μL、QIAcuity Master Mix 10μL，RNase
‑
free water补足至40μL；
[0023]所述ddPCR反应的程序为：95℃2min；95℃15s，58℃30s，40个循环；
[0024]所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述探针ApN
‑
pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测苹果坏死花叶病毒的ddPCR引物对，其特征在于，所述ddPCR引物对包括上游引物ApN
‑
ddF3和下游引物ApN
‑
ddR3；所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。2.一种检测苹果坏死花叶病毒的探针，其特征在于，所述探针包括探针ApN
‑
pb3；所述探针ApN
‑
pb3的5
’
端添加Cy5抗原标记，3
’
端添加BHQ
‑
3抗原标记；所述探针ApN
‑
pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。3.一种检测苹果坏死花叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括ddPCR引物对及其对应的探针ApN
‑
pb3、反应缓冲液和阳性对照；所述ddPCR引物对包括上游引物ApN
‑
ddF3和下游引物ApN
‑
ddR3；所述上游引物ApN
‑
ddF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物ApN
‑
ddR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述探针ApN
‑
pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。4.一种检测苹果坏死花叶病毒的方法，其特征在于，该方法为：S1、提取含有苹果坏死花叶病毒的待测样品的总RNA，逆转录得到模板cDNA；S2、用ddPCR引物对和探针ApN
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【专利技术属性】
技术研发人员：郝兴安，安玮，王岩滨，李殷，曾嫱，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：