一种大肠杆菌O157:H7可视化快速检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种大肠杆菌O157:H7可视化快速检测体系及其试剂盒。针对大肠杆菌O157:H7特异性靶基因，使用SYBR Green荧光指示剂进行环介导等温扩增体系的建立并用钙黄绿素作为可视化指示剂代替荧光指示剂，建立了检测大肠杆菌O157:H7的可视化LAMP技术。本发明专利技术创造性建立了定量及可视化LAMP检测新技术，可以准确、快速地鉴定出大肠杆菌O157:H7，具备高特异、高灵敏度和抗干扰能力。除此，将建立的可视化LAMP检测体系组装成商品试剂盒，减少检测步骤，提高检测的便捷性，满足现场检测和批量检测的需求。测的需求。测的需求。

【技术实现步骤摘要】
Green作为荧光指示剂的初始反应体系，再以钙黄绿素指示剂替换荧光指示剂建立可视化反应体系，使得能够快速、准确地鉴定出大肠杆菌O157:H7。
[0008]在具体的实施方案中，所述方法包括如下步骤：
[0009]步骤1，确定靶基因，设计LAMP引物；
[0010]步骤2，初始LAMP体系的确定；
[0011]步骤3，LAMP方法的程序优化(如引物比例优化、dNTPs浓度优化、Mg
2+
浓度优化、Bst 3.0DNA聚合酶添加量优化、反应温度优化)，确定荧光定量LAMP扩增体系；
[0012]步骤4，荧光定量LAMP技术灵敏度的测定；
[0013]步骤5，可视化探索(如，可视化指示剂配制、可视化LAMP反应时间优化)，确定可视化LAMP扩增体系。
[0014]在具体的实施方案中，LAMP引物的序列为：
[0015]F3：5
’–
GGTTATATTTATGACTTTCACACTG
–3’
，如SEQ ID No：1所示；
[0016]B3：5
’–
AGCGAACCATTTTAATTGAGG
–3’
，如SEQ ID No：2所示；
[0017]FIP：5
’–
TGTTAGCGCAATTGACATCAATTTACTATCCTTCATTTTTTAGTAAGCG
–3’
，如SEQ ID No：3所示；
[0018]BIP：5
’–
ATGCACATTCAGTTATTACCGATGCGCATGGACTAAATGGAAGAG
–3’
，如SEQ ID No：4所示；
[0019]LF：5
’–
AACACATTCCTTTGATCTATT
–3’
，如SEQ ID No：5所示；
[0020]LB：5
’–
GGGATTATTCTGCAAAACTAC
–3’
，如SEQ ID No：6所示。
[0021]在具体的实施方案中，本专利技术最终确定的LAMP扩增体系组成为：采用25μL扩增体系，包括外侧引物(F3和B3)各0.2μM，内侧引物(FIP和BIP)各0.8μM，环引物(LF和LB)各0.4μM，dNTPs终浓度1.2mM，Mg
2+
终浓度6.0mM，10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，Bst 3.0DNA聚合酶终浓度0.32U/μL，2μL DNA 模板，荧光定量LAMP检测时加入20
×
SYBR Green 1μL，加水补足25μL；可视化LAMP检测时加入钙黄绿素
‑
氯化锰指示剂1μL，加水补足25μL。
[0022]在具体的实施方案中，本专利技术最终确定的LAMP检测体系扩增程序：荧光定量LAMP反应程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号；可视化LAMP反应程序为：65℃反应40分钟。
[0023]在具体的实施方案中，(1)当使用荧光定量LAMP反应结束后，检测结果有扩增曲线，Times值不超过30，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性；(2)当可视化LAMP反应结束后，反应管内颜色由橙黄色变为绿色，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性。
[0024]针对荧光定量LAMP检测，以菌液为模板时，检测灵敏度为8.8
×
100CFU/mL；以基因组为模板时，检测灵敏度为4.61fg/μL。
[0025]相比于用凝胶电泳判断试验结果的LAMP方法，可实现闭管检测，减少样品出现交叉污染，减小了假阳性结果出现概率，并省去了电泳检测的繁琐操作；相比于TaqMan探针法，无需合成荧光基团修饰探针，更为经济实惠；相比于传统的国标法检测，步骤更简单，缩短了检测周期，能够到达快速检测的目的，同时准确性高、结果可靠。
[0026]在前述检测体系建立的基础上，本专利技术确立可视化LAMP新型快速检测商品试剂盒，应用于实际检验检测工作中时各方面性能优良，能满足大肠杆菌O157:H7快速、准确、高
效的实际检测需要和现场检测、批量检测的检测需求。
[0027]第二方面，本专利技术首先保护一种利用LAMP技术检测大肠杆菌O157:H7的引物，所述引物针对靶基因ECs_2840，序列为：
[0028]F3：5
’–
GGTTATATTTATGACTTTCACACTG
–3’
，如SEQ ID No：1所示；
[0029]B3：5
’–
AGCGAACCATTTTAATTGAGG
–3’
，如SEQ ID No：2所示；
[0030]FIP：5
’–
TGTTAGCGCAATTGACATCAATTTACTATCCTTCATTTTTTAGTAAGCG
–3’
，如SEQ ID No：3所示；
[0031]BIP：5
’–
ATGCACATTCAGTTATTACCGATGCGCATGGACTAAATGGAAGAG
–3’
，
[0032]如SEQ ID No：4所示；
[0033]LF：5
’–
AACACATTCCTTTGATCTATT
–3’
，如SEQ ID No：5所示；
[0034]LB：5
’–
GGGATTATTCTGCAAAACTAC
–3’
，如SEQ ID No：6所示。
[0035]第三方面，本专利技术保护一种大肠杆菌O157:H7的检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有权利要求1所述的引物组。
[0036]在具体的实施方案中，在组建试剂盒时，需要包含以下步骤：(1)试剂盒的组装；(2)试剂盒的灵敏度评估；(3)试剂盒的特异性评估；(3)试剂盒的抗干扰性能评估；(4)试剂盒的稳定性评估(重复性)；(5)试剂盒的人工污染试验。
[0037]在更具体的实施方案中，本专利技术保护一种大肠杆菌O157:H7的检测试剂盒，所述试剂盒采用LAMP扩增体系，包括外侧引物(F3和B3)各0.2μM，内侧引物(FIP和BIP)各0.8μM，环引物(LF和LB)各0.4μM，dNTPs终浓度1.2mM，Mg
2+
终浓度6.0mM，10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，Bst 3.0DNA聚合酶终浓度0.32U/μL，指示剂1μL，2μL DNA模板，加水补足25μL。
[0038]优选的，所述试剂盒为荧光定量试剂盒，采用荧光定量LAMP扩增体系，包括外侧引物(F3和B3)各0.2μM，内侧引物(FIP和BIP)各0.8μM，环引物(LF和LB)各0.4μM，dNTPs终本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌O157:H7的可视化快速检测体系，其特征在于，所述检测体系通过如下方法建立：针对大肠杆菌O157:H7特异性基因ECs_2840，设计LAMP引物，使用环介导等温扩增的方法，建立以SYBR Green作为荧光指示剂的荧光定量LAMP扩增体系，再以钙黄绿素指示剂替换荧光指示剂建立可视化LAMP扩增体系，以鉴定大肠杆菌O157:H7；优选的，所述LAMP引物的序列为：F3：5
’–
GGTTATATTTATGACTTTCACACTG
–3’
，如SEQ ID No：1所示；B3：5
’–
AGCGAACCATTTTAATTGAGG
–3’
，如SEQ ID No：2所示；FIP：5
’–
TGTTAGCGCAATTGACATCAATTTACTATCCTTCATTTTTTAGTAAGCG
–3’
，如SEQ ID No：3所示；BIP：5
’–
ATGCACATTCAGTTATTACCGATGCGCATGGACTAAATGGAAGAG
–3’
，如SEQ ID No：4所示；LF：5
’–
AACACATTCCTTTGATCTATT
–3’
，如SEQ ID No：5所示；LB：5
’–
GGGATTATTCTGCAAAACTAC
–3’
，如SEQ ID No：6所示；优选的，所述荧光定量LAMP扩增体系，包括外侧引物F3和B3各0.2μM，内侧引物FIP和BIP各0.8μM，环引物LF和LB各0.4μM，dNTPs终浓度1.2mM，Mg
2+
终浓度6.0mM，10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，Bst 3.0DNA聚合酶终浓度0.32U/μL，20
×
SYBR Green 1μL，2μL DNA 模板，加水补足25μL；更优选的，荧光定量LAMP反应程序：扩增程序为：65℃反应1小时，每隔1分钟收集1次荧光信号；优选的，所述可视化LAMP扩增体系，包括外侧引物F3和B3各0.2μM，内侧引物FIP和BIP各0.8μM，环引物LF和LB各0.4μM，dNTPs终浓度1.2mM，Mg
2+
终浓度6.0mM，10
×
Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，Bst 3.0DNA 聚合酶终浓度0.32U/μL，钙黄绿素
‑
氯化锰指示剂1μL，2μL DNA模板，加水补足25μL；更优选的，可视化LAMP反应程序：扩增程序为：65℃反应40分钟。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7的可视化快速检测体系，其特征在于，(1)当使用荧光定量LAMP反应结束后，检测结果有扩增曲线，Times值不超过30，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性；(2)当可视化LAMP反应结束后，反应管内颜色由橙黄色变为绿色，可判断检测结果为阳性；反之则为阴性。3.一种大肠杆菌O157:H7的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1
‑
2任一所述的检测体系。4.一种大肠杆菌O157:H7的检测引物，其特征在于，所述引物针对靶基因ECs_2840设计，引物序列为：F3：5
’–
GGTTATATTTATGACTTTCACACTG
–3’
，如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，王祖未，陆兆新，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：