一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，包括以下步骤：(1)配制液体培养基；(2)液化痰液；(3)菌群培养；(4)与裂解液混合；(5)离心混合液；(6)洗脱核酸；(7)纳米孔测序技术检测核酸。本发明专利技术首先将牛初乳、葡萄糖、Middlebrook7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用


[0001]本专利技术属于结核分枝杆菌
，具体涉及一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌，俗称结核杆菌，是引发结核病的一种细菌。结核病是一种慢性传染性疾病，主要通过呼吸道传播，传染源主要是排菌的肺结核病人的痰。尽管结核病是一种可治愈的疾病，但结核病目前仍是全球十大死亡原因之一，并且全球的结核病发病率和死亡率下降缓慢。据世界卫生组织报道，2019年全球估计有1000万人罹患结核病和140万人死于结核病。
[0003]现有的结核病诊断方法包括痰涂片镜检法、分枝杆菌菌种鉴定法和痰结核菌常规培养法等。其中痰涂片镜检法快速和价廉，但无法辨别死菌活菌且特异性差；分枝杆菌菌种鉴定法可以精确地鉴定分枝杆菌的不同菌种，但操作复杂且部分使用的药品具有一定危险性；痰结核菌常规培养法可鉴定死菌活菌，但耗费时间长且敏感性低。此外由于结核分枝杆菌的细胞壁中含有大量类脂，占细菌干重的23.77％，其中40％为蜡质，并且结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，因此结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，导致提取结核分枝杆菌核酸较困难。
[0004]世界卫生组织于2015年提出《终结结核病战略》，即到2030年结核病死亡率和发病率分别降低90％和80％，到2035年结核病死亡率和发病率分别降低95％和90％。为了实现这个目标，本专利技术提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，提高结核病实验室诊断能力，缩短诊断时间，实行结核病的早期快速诊断及其耐药性检测，达到治疗用药有效和有针对性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是解决现有技术的不足，提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法及应用，具体采用以下的技术方案：
[0006]一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法，包括以下步骤：
[0007](1)配制液体培养基，所述液体培养基的原料包括牛初乳、葡萄糖、Middlebrook 7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温
‑
80，其中所述牛初乳、葡萄糖、Middlebrook 7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温
‑
80的质量比为1.5
‑
2.5：2.0
‑
3.0：1.0
‑
1.8：1.2
‑
2.4：0.05
‑
0.15：0.5
‑
0.7：0.6
‑
1.0；
[0008](2)液化痰液，收集患者痰液，加入1
‑
2倍体积的质量百分含量为4％的NaOH溶液至所述患者痰液中，震荡，充分液化所述患者痰液；
[0009](3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整pH至6.5
‑
6.8，37℃培养，菌落生长10
‑
14天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群；
[0010](4)与裂解液混合，将步骤(3)获得的高浓度结核分枝杆菌群，加入1.0
‑
1.2倍裂解
液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，裂解液由2
‑
4mol/L尿素、2
‑
4mol/L氯化钾、1.5
‑
2.5mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、20
‑
60g/L十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/L磷酸钾缓冲液组成，所述裂解液pH＝6.0；
[0011](5)离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置，磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液pH＝6.0；
[0012](6)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液pH＝4.0,所述洗脱液pH＝9.0；
[0013](7)使用纳米孔测序技术检测步骤(6)得到的结核分枝杆菌核酸，构建纳米孔测序文库。
[0014]优选的，步骤(1)具体步骤为：以质量份称取1.0
‑
1.8份Middlebrook 7H9肉汤基础，至200
‑
350份蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃，得到Middlebrook 7H9肉汤基础溶液，添加1.5
‑
2.5份牛初乳、2.0
‑
3.0份葡萄糖、1.2
‑
2.4份椰汁、0.05
‑
0.15份叶酸、0.5
‑
0.7份甘油和0.6
‑
1.0份吐温
‑
80至Middlebrook 7H9肉汤基础溶液中，混合均匀后，得到液体培养基。
[0015]优选的，步骤(2)中，震荡25min
‑
30min。
[0016]优选的，步骤(3)中，菌落生长12天。
[0017]优选的，步骤(6)中，所述清洗液为盐酸溶液，所述洗脱液为氢氧化钠溶液。
[0018]优选的，步骤(7)具体步骤为：
[0019](1)设计结核分枝杆菌特异性分型基因IS6100、hsp65、rpoB和gyrA引物；
[0020](2)在各个正向引物
‑
F的5
’
端加上TTTCTGTTGGTGCTGATATTG碱基填充序列，各个反向引物
‑
R的5
’
端加上ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC碱基填充序列，得到含有第二轮PCR引物结合位点的扩增引物；
[0021](3)将第二轮PCR引物结合位点的扩增引物稀释，混合各基因的正反向引物；其次将混合后的引物形成引物池；
[0022](4)合成适用于第二轮PCR的Barcode标签引物，将所有barcode干粉引物稀释，并将相同barcode的正反向引物混合，形成barcode引物池；
[0023](5)用引物池对结核分枝杆菌核酸进行第一轮扩增并纯化；
[0024](6)用Barcode引物进行第二轮扩增并纯化；
[0025](7)构建纳米孔测序文库并纯化。
[0026]优选的，IS6100的引物序列包含具有SEQ01所示的核苷酸序列和包含具有SEQ02所示的核苷酸序列；hsp65的引物组包含具有SEQ03所示的核苷酸序列和包含具有SEQ04所示的核苷酸序列；rpoB的引物组包含具有SEQ05所示的核苷酸序列和包含具有SEQ06所示的核苷酸序列；gyrA的引物组包含具有SEQ07所示的核苷酸序列和包含具有SEQ08所示的核苷酸序列。
[0027]本专利技术还提供一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法在快速鉴定结核杆菌的应用。
[0028]本专利技术的有益效果为：由于结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，因此结核杆菌细胞壁较一般细菌坚固，导致提取结核分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效提取结核分枝杆菌核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制液体培养基，所述液体培养基的原料包括牛初乳、葡萄糖、Middlebrook 7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温
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80，其中所述牛初乳、葡萄糖、Middlebrook 7H9肉汤基础、椰汁、叶酸、甘油和吐温
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80的质量比为1.5
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2.5：2.0
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3.0：1.0
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1.8：1.2
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2.4：0.05
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0.15：0.5
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0.7：0.6
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1.0；(2)液化痰液，收集患者痰液，加入1
‑
2倍体积的质量百分含量为4％的NaOH溶液至所述患者痰液中，震荡，充分液化所述患者痰液；(3)菌群培养，将步骤(2)充分液化后的痰液接种于步骤(1)配制的液体培养基中，调整pH至6.5
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6.8，37℃培养，菌落生长10
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14天，保留上清液，获得高浓度结核分枝杆菌群；(4)与裂解液混合，将步骤(3)获得的高浓度结核分枝杆菌群，加入1.0
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1.2倍裂解液混合，得到混合液，混合液100℃处理20min，裂解液由2
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4mol/L尿素、2
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4mol/L氯化钾、1.5
‑
2.5mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1％聚乙二醇辛基苯基醚、20
‑
60g/L十六烷基三甲基溴化铵和0.2mol/L磷酸钾缓冲液组成，所述裂解液pH＝6.0；(5)离心混合液，取上清液与磁珠悬液混合，静置，磁珠悬液包括聚乙烯亚胺修饰的磁珠，所述磁珠悬液pH＝6.0；(6)洗脱核酸，通过磁力架吸附磁珠后，弃去上清液，用清洗液洗去磁珠表面吸附的杂质，用洗脱液对吸附于磁珠表面的核酸进行洗脱，分离得到结核分枝杆菌核酸，所述清洗液pH＝4.0,所述洗脱液pH＝9.0；(7)使用纳米孔测序技术检测步骤(6)得到的结核分枝杆菌核酸，构建纳米孔测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体步骤为：以质量份称取1.0
‑
1.8份Middlebrook 7H9肉汤基础，至200
‑
350份蒸馏水中，121℃高压...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈开森，夏良华，于圣铭，
申请(专利权)人：南昌市高新区人民医院南昌大学第一附属医院高新医院，
类型：发明
国别省市：