一种高产纤维素产生菌的筛选方法技术

本发明专利技术涉及生物领域，且公开了一种高产纤维素产生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：准备固体培养基以及液体培养基；第二步：融化的菌液均匀涂抹在琼脂糖培养基斜面上，培养；第三步：将颜色最红、体积最大的菌落接种到液体培养基中，并且加入1000U/ml纤维素酶，培养；第四步：离心，弃去培养上清，加入3ml液体培养基重悬菌体后，重复两次；第五步：加入500μl液体培养基将菌体沉淀重悬；第六步：取2μl重悬菌液，通过革兰氏染色的方法将染色菌体，在光学显微镜下进行计数；第七步：通过计数计算出菌液中的菌体密度，然后将10^7的菌体接入到20ml液体培养基中静置培养7天；第八步：收获细菌纤维素。收获细菌纤维素。收获细菌纤维素。

【技术实现步骤摘要】
一种高产纤维素产生菌的筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体为一种高产纤维素产生菌的筛选方法。

技术介绍

[0002]纤维是指由连续或不连续的细丝组成的物质。在动植物体内，纤维在维系各个组织方面起到重要作用。是动物和植物体内组织的重要组成部分。纤维用途广泛，可织成细线、线头和麻绳，造纸或织毡时还可以织成纤维层；同时也常用来制造其他物料，及与其他物料共同组成复合材料。
[0003]日常中使用的纤维多来自于动物和植物，除了从动物和植物当中提取纤维之外，也可以通过微生物来生产纤维。依据纤维种类的不同，纤维在微生物体内会经历不同的加工过程。例如：部分蛋白纤维可由蛋白质自行交联自组装而形成，而在微生物体内，蛋白质通过基因的转录、翻译等过程而生成。由于微生物生长周期短，培养成本低于动物和植物，利用微生物生成纤维成为了一个生产纤维的未来方向。
[0004]如上所述，如果希望通过微生物生产纤维，筛选出能高效产生所需要的纤维的菌株(高产菌株)便成为了一个需要研究的课题。其中，如何在时间和空间上定量衡量菌株产生的纤维量是高产菌株筛选需要解决的核心问题，为此我们提出了一种高产纤维素产生菌的筛选方法。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高产纤维素产生菌的筛选方法，可以对菌种进行筛选，从而可以在后续领域进一步利用。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述所述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高产纤维素产生菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0009]第一步：准备固体培养基以及液体培养基；
[0010]第二步：融化的菌液均匀涂抹在琼脂糖培养基斜面上，培养；
[0011]第三步：将颜色最红、体积最大的菌落接种到液体培养基中，并且加入1000U/ml纤维素酶，培养；
[0012]第四步：离心，弃去培养上清，加入3ml液体培养基重悬菌体后，重复两次；
[0013]第五步：加入500μl液体培养基将菌体沉淀重悬；
[0014]第六步：取2μl重悬菌液，通过革兰氏染色的方法将染色菌体，在光学显微镜下进行计数；
[0015]第七步：通过计数计算出菌液中的菌体密度，然后将10^7的菌体接入到20ml液体培养基中静置培养7天；
[0016]第八步：收获细菌纤维素。
[0017]优选的，所述第一步中的液体培养基包括5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、2.7g/LNa2HPO4、1.5g/L柠檬酸、10g/L葡萄糖(在灭菌后加入)、硫酸镁0.5g/L，pH5.0；
[0018]固体培养基包括5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、2.7g/LNa2HPO4、1.5g/L柠檬酸、0.1g/L刚果红、10g/L葡萄糖(在灭菌后加入)、10mL/L无水乙醇(在灭菌后加入)、20g/L琼脂粉，pH5.0。
[0019]优选的，所述第二步中的培养为恒温培养箱30度倒置培养72h。
[0020]优选的，所述第三步中的培养为恒温震荡培养箱30度，220rpm，培养72小时。
[0021]优选的，所述第四步中的离心为离心机3000g离心10分钟。
[0022]优选的，所述第八步的具体内容为：对湿润的细菌纤维素薄膜进行压制处理，将水分压出并晾干为细菌纤维素干燥薄膜，称量薄膜重量以比较不同菌株在同一初始密度同一培养条件下的细菌纤维素生产情况。
[0023](三)有益效果
[0024]与现有技术相比，本专利技术提供了一种高产纤维素产生菌的筛选方法，具备以下有益效果：
[0025]1、该高产纤维素产生菌的筛选方法，实现了完全的定量筛选，控制了初始菌液的密度一直，使得同一组之间的结果真正具有可比较性。旧有的筛选方式只是筛选出了有纤维素生产能力的菌种，但是没有考虑到纤维素本身会包裹菌体、不同实验组菌体生长速度不一致等问题，最终使得纤维素生产情况受多种因素影响，缺乏说服力。
[0026]2、该高产纤维素产生菌的筛选方法，实现了不同空间、不同时间尺度上菌种纤维素生产能力的相互比较，具有高可重复、高严谨性的特点。在保证所有培养条件一致的情况下，本筛选方法完全控制了菌种密度这一变量，使得菌种的纤维素生产能力作为唯一影响变量。
[0027]3、该高产纤维素产生菌的筛选方法，实现了快速菌种密度的精确定量检测。旧有的检测方案，如OD600检测菌体为半定量检测方法，有着很大的误差；而涂布计数法又需要超过两天的等待时间。该新型筛选方法，通过计数显微镜下革兰氏染色的菌体数量，能够达到快速精确确定菌体密度的目的。
附图说明
[0028]图1为本专利技术流程示意图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]请参阅图1，实施例1：一种新型的高产纤维素产生菌的筛选方法，筛选出具有高度产膜能力的醋酸杆菌。
[0031]具体实施步骤：
[0032]步骤1、培养基配置：液体培养基：5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.7g/LNa2HPO4，
1.5g/L柠檬酸，10g/L葡萄糖(在灭菌后加入)，硫酸镁0.5g/L，pH5.0
[0033]固体培养基：5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.7g/LNa2HPO4，1.5g/L柠檬酸，0.1g/L刚果红，10g/L葡萄糖(在灭菌后加入)，10mL/L无水乙醇(在灭菌后加入)，20g/L琼脂粉，pH5.0
[0034]步骤2、活化：融化的醋酸杆菌菌液均匀涂抹在琼脂糖培养基斜面上，恒温培养箱30度倒置培养72h。
[0035]步骤3、扩大：将颜色最红、体积最大的醋酸杆菌菌落接种到液体培养基中，并且加入1000U/ml纤维素酶，恒温震荡培养箱30度，220rpm，培养72小时。
[0036]步骤4、收获：离心机3000g离心10分钟，小心弃去培养上清，加入3ml液体培养基重悬醋酸杆菌菌体后，重复步骤4两次。
[0037]步骤5、稀释：加入500μl液体培养基将醋酸杆菌菌体沉淀重悬。
[0038]步骤6、计数：取2μl重悬醋酸杆菌菌液，通过革兰氏染色的方法将染色醋酸杆菌菌体，在光学显微镜下进行计数。
[0039]步骤7、接种：通过计数计算出菌液中的醋酸杆菌菌体密度，然后将10^7的菌体接入到20ml液体培养基中静置培养7天。
[0040]步骤8、称量：收获细菌纤维素，对湿润的醋酸杆菌细菌纤维素薄膜进行压制处理，将水分压出并晾干为细菌纤维素干燥薄膜，称量薄膜重量以比较不同菌株在同一初始密度同一培养条件下的细菌纤维素生产情况。
[0041]对比例2：醋酸杆菌平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产纤维素产生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：准备固体培养基以及液体培养基；第二步：融化的菌液均匀涂抹在琼脂糖培养基斜面上，培养；第三步：将颜色最红、体积最大的菌落接种到液体培养基中，并且加入1000U/ml纤维素酶，培养；第四步：离心，弃去培养上清，加入3ml液体培养基重悬菌体后，重复两次；第五步：加入500μl液体培养基将菌体沉淀重悬；第六步：取2μl重悬菌液，通过革兰氏染色的方法将染色菌体，在光学显微镜下进行计数；第七步：通过计数计算出菌液中的菌体密度，然后将10^7的菌体接入到20ml液体培养基中静置培养7天；第八步：收获细菌纤维素。2.根据权利要求1所述的一种高产纤维素产生菌的筛选方法，其特征在于：所述第一步中的液体培养基包括5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、2.7g/LNa2HPO4、1.5g/L柠檬酸、10g/L葡萄糖(在灭菌后加入)、硫酸镁0.5g/L，pH5.0。3.根据权利要求1所述的一种高产纤维素产生菌的筛选方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏睿，徐欢笛，文昱杰，薛睿轩，
申请(专利权)人：上海贻如生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：