本发明专利技术公开了一种检测个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测伊立替康用药靶向位点ＣＰＴ－１１基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量ＰＣＲ常规组件等。本发明专利技术的试剂盒通过检测伊立替康用药靶向位点ＣＰＴ－１１基因多态性位点来评估个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种检测个体伊立替 康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒，通过检测伊立替康用药靶向位点CPT-11基因多态性位点 来评估个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效。
技术介绍
大肠癌包括结肠癌和直肠癌(colorectal carcinoma)，是常见的恶性肿瘤。其发 病率在世界不同地区差异很大，以北美、大洋洲最高，欧洲居中，亚非地区较低。我国南方， 特别是东南沿海明显高于北方。近20多年来，世界上多数国家大肠癌(主要是结肠癌)发 病率呈上升趋势。我国大肠癌发病率上升趋势十分明显。伊立替康，商品名为开普拓(Campto)，由日本研制，1994年在日本上市，1996年获 准在美国上市，1999年4月获中国国家行政保护。伊立替康属于半合成喜树碱的衍生物， DNA拓扑异构酶I抑制剂，可诱导单链DNA损伤，从而阻断DNA复制叉，产生作用于S期的细 胞毒性。伊立替康主要用于大肠癌、肺癌等的治疗。Irinotecan(CPT-Il)是一种用于治疗各种实体瘤(如结肠癌和肺癌等)的一线抗 癌药物。作为一种前药，CPT-Il需要在体内通过羧酸酯酶(arboxylesterase)作用转化为 具有活性作用的物质SN-38，后者通过抑制拓扑异构酶I活性发挥抗肿瘤效应。肝组织中的 尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶(UGTlAl)能催化SN-38转化为极性的SN-38葡醛酸苷，然 后从胆汁和尿中排出体外，从而灭活SN-38的生物活性。CPT-Il的剂量限制性毒性包括腹 泻和中性粒细胞减少，并且这些毒性的产生与SN-38的过量形成密切相关。个体间UGTlAl 的差异表达会引起SN-38代谢速率的改变，从而与CPT-Il药物反应密切相关。CPT-Il是一种拓扑异构酶I抑制剂，其药动学参数及毒性(如腹泻、骨髓抑制， 由SN-38所致)存在着显著的个体差异，这些差异的产生目前认为是由于其活性代谢产物 SN-38的葡醛酸化水平不同所致。体外研究证实SN-38的葡醛酸化具有显著的个体差异，有 轻度胆红素血症的患者，如吉伯特综合征(Gilbert)患者，使用CPT-Il治疗时，其发生毒性 反应的危险性可能会更高。SN-38主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代谢生成SN-38G，后者 可随尿液或胆汁从体内排出。常见的SNP 主要包括以下几种UGTlAl*28(-40_-39insTA)、UGT1A1*6 (211G > A)、 UGT1A1*27 (686C > A)。这些SNP通过影响转录活性或导致氨基酸改变来影响酶的活性。其 中UGT1A1*6(G71R)可使酶活性减少51%，UGT1A1*27 (686C > Α)可显著降低酶活性，而位 于5’端上游转录调控区的UGT1A1*28则通过影响基因转录水平来影响酶活性，可使转录活 性下降18-30% ο
技术实现思路
基于伊立替康用药靶向位点CPT-Il基因多态性可用来评估个体伊立替康辅助治 疗肠癌疗效的基础上，本专利技术提供一种检测个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测伊立替康用药靶向位点CPT-Il基因基因多态性位点的特异性引物对及特异 性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本专利技术试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应缓冲液1 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1,25mM MgC12 溶液 0· 6μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,20 μ M特异性引物对每条引物各0.225 μ 1，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水 5. 325 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总 体积10 μ 1，包含浓度为20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针 各0. 25μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。权利要求一种检测个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒，其特征在于包括检测伊立替康用药靶向位点CPT 11基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液1 μ 1，`25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,`25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，`5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,`20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，`10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。全文摘要本专利技术公开了一种检测个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测伊立替康用药靶向位点CPT-11基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本专利技术的试剂盒通过检测伊立替康用药靶向位点CPT-11基因多态性位点来评估个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效。文档编号G01N21/64GK101928754SQ200910053949公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日专利技术者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测个体伊立替康辅助治疗肠癌疗效的试剂盒，其特征在于：包括检测伊立替康用药靶向位点ＣＰＴ－１１基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ混合液、ＭｇＣｌ↓［２］溶液、荧光定量ＰＣＲ反应缓冲液、去离子水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯哲民，邹祖烨，
申请(专利权)人：上海主健生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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