本发明专利技术涉及一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，包括：配制流动相Ａ溶液：乙酸－乙酸钠缓冲溶液和流动相Ｂ溶液：乙酸－乙酸钠－氯化钠缓冲溶液；分别将精制的木瓜蛋白酶和粗制的木瓜蛋白酶置入５０ｍｌ容量瓶内，加入流动相Ａ溶液至５０ｍｌ刻度线定容，摇匀，至木瓜蛋白酶充分溶解；最后利用快速蛋白质液相色谱ＦＰＬＣ的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积比值的公式来计算木瓜蛋白酶的纯度。该测定方法快速、操作简单，耗时少，结果可信，重复性高，为精确测定木瓜蛋白酶的纯度提供依据，具有重要的学术价值和实际应用意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属木瓜蛋白酶纯度测定领域，特别是涉及一种利用快速蛋白质液相色谱测定木 瓜蛋白酶纯度的方法。
技术介绍
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Caricapapaya)的 根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。广泛地应用于食品行业，如啤 酒的澄清和肉质的嫩化以及皮革、纺织、日化和制药工业。近年来科学研究发现，木瓜蛋 白酶在医药工业中有着巨大的实用价值，含有木瓜蛋白酶的药物能起到抗癌、抗肿瘤和淋 巴性白血病的作用。由于制药工业对木瓜蛋白酶的纯度要求比较高，如何建立一种快速、 高效又精确地测定木瓜蛋白酶纯度的方法，是大家研究的热点。目前，最常用的测定木瓜蛋白酶纯度的方法是分别测定样品中木瓜蛋白酶的酶活力和 蛋白质含量后计算样品的比酶活，这种方法的缺点是酶活和蛋白质含量测定都存在一定得 误差，能够测量的木瓜蛋白酶的浓度范围有限，而且操作步骤繁琐、重复性差，尤其是当 木瓜蛋白酶浓度过高或过低时，都会产生很大的测量误差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯 度的方法，该测定方法快速、操作简单，耗时少，结果可信，重复性高，为精确测定木瓜 蛋白酶的纯度提供依据，具有重要的学术价值和实际应用意义。本专利技术的一种，包括(1) 配制流动相流动相A溶液0.02~0.1 mol/LpH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；流动相B溶液含1.0-2.0 mol/L氯化钠的0.02-0.lmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；(2) 制备对照品溶液将精制木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶内，加入流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀， 至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶对照品溶液；(3) 制备供试样品溶液将粗制木瓜粉置于50ml容量瓶中，加入流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀，经滤 纸过滤，备用；3(4)利用快速蛋白质液相色谱FPLC的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积比 值的公式来计算木瓜蛋白酶的纯度。所述步骤(1)中的流动相A溶液为0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；所述步骤(1)中的流动相B溶液为含2.0mol/L氯化钠的0.05 mol/LpH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；所述步骤(2)中的木瓜蛋白酶的用量为250mg-500mg; 所述步骤(3)中的粗制木瓜蛋白酶的用量为300mg-500mg;所述步骤(4)中的色谱条件是离子交换柱为HiTrapTMSPXLlml，流动相A溶液为 0.02 ~0.1 mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，流动相B溶液为含1.0~2.0mol/L氯化钠的 0.02~0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，上样量为250-500 nl,平衡为5~10个柱床， 冲洗为5~7个柱床，洗脱梯度为流动相B溶液在15~25个柱床内由0%线性增加至 70%-100%，流速为0.8~1.0ml/min;所述的木瓜蛋白酶的纯度计算方法X=(粗制木瓜蛋白酶的峰面积X精制木瓜蛋白酶 的浓度/精制木瓜蛋白酶的峰面积X粗制木瓜蛋白酶的浓度)X 100%。 有益效果本专利技术的测定方法快速、操作简单，耗时少，结果可信，重复性高，为精确测定木瓜 蛋白酶的纯度提供依据，具有重要的学术价值和实际应用意义。 附图说明图1为利用快速蛋白质液相色谱(FPLC)对精制木瓜蛋白酶溶液进行离子交换色谱分析所 得到色谱图2为利用快速蛋白质液相色谱(FPLC)对粗制木瓜蛋白酶溶液进行离子交换色谱分析所得到色谱图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而 不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1利用快速蛋白质液相色谱(FPLC)测定木瓜蛋白酶的纯度，具体步骤如下 (1)配制流动相称取乙酸钠配制成0.05mol/L乙酸钠溶液、氯化钠，量取去离子水，按4比例配制成流动相A、 B溶液。流动相A溶液称取4.102g乙酸钠配制成体积为1L的0.05mol/LpH 4.5乙酸-乙酸钠 的缓冲液；流动相B溶液:称取4.102g乙酸钠，58.44g氯化钠配制成体积为1L的0.05mol/L pH4.5 乙酸-乙酸钠-氯化钠缓冲液；(2)制备对照品溶液精确称取精制木瓜蛋白酶500mg，置入50ml容量瓶内，加入 流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶对照 品溶液；G)制备供试样品溶液称取粗制木瓜粉500mg，置于50ml容量瓶中，加入流动相A 溶液至50ml刻度线定容，摇匀，经滤纸过滤，备用；(4)利用FPLC的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积比值的公式来计算 木瓜蛋白酶的纯度。色谱条件是离子交换柱为HiTrapTM SP XL lml，流动相A溶液为O.05mol/L pH 4.5的 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，流动相B溶液为含l.Omol/L氯化钠的0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙 酸钠缓冲溶液，上样量为50(^1，平衡为5个柱床，冲洗为5个柱床，洗脱梯度为流动相B 溶液在15个柱床内由0%线性增加至70%，流速为1.0ml/min。实施例2利用快速蛋白质液相色谱(FPLC)测定木瓜蛋白酶的纯度，具体步骤如下(1) 配制流动相称取乙酸钠配制成0.05mol/L乙酸钠溶液、氯化钠，量取去离子水， 按比例配制成流动相A、 B溶液。流动相A溶液称取4.102g乙酸钠配制成体积为1L的0.05mol/LpH 4.5乙酸-乙酸钠 的缓冲液；流动相B溶液:称取4.102g乙酸钠，U6.88g氯化钠配制成体积为1L的O.05mol/L pH4.5 乙酸-乙酸钠-氯化钠缓冲液；(2) 制备对照品溶液精确称取精制木瓜蛋白酶500mg，置入50ml容量瓶内，加入 流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶对照 品溶液；(3) 制备供试样品溶液称取粗制木瓜粉500mg，置于50ml容量瓶中，加入流动相A 溶液至50ml刻度线定容，摇匀，经滤纸过滤，备用；(4)利用FPLC的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积比值的公式来计算 木瓜蛋白酶的纯度。色谱条件是离子交换柱为HiTrap SP XL lml，流动相A溶液为0.05 mol/LpH 4.5的 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，流动相B溶液为含2.0mol/L氯化钠的0.05mol/LpH 4.5的乙酸-乙 酸钠缓冲溶液，上样量为500^1，平衡为5个柱床，冲洗为5个柱床，洗脱梯度为流动相 B溶液在20个柱床内由0%线性增加至100%,流速为0.8ml/min。权利要求1.一种，包括(1)配制流动相流动相A溶液0.02～0.1mol/L pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；流动相B溶液含1.0～2.0mol/L氯化钠的0.02～0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；(2)制备对照品溶液将木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶内，加入流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，包括： （１）配制流动相 流动相Ａ溶液：０．０２～０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ４．５的乙酸－乙酸钠缓冲溶液； 流动相Ｂ溶液：含１．０～２．０ｍｏｌ／Ｌ氯化钠的０．０２～０．１ｍ ｏｌ／ＬｐＨ４．５的乙酸－乙酸钠缓冲溶液； （２）制备对照品溶液 将木瓜蛋白酶置入５０ｍｌ容量瓶内，加入流动相Ａ溶液至５０ｍｌ刻度线定容，摇匀，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶对照品溶液； （３）制备供试样品溶液 将粗制木瓜粉置于５０ｍｌ容量瓶中，加入流动相Ａ溶液至５０ｍｌ刻度线定容，摇匀，经滤纸过滤，备用； （４）利用快速蛋白质液相色谱ＦＰＬＣ的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积比值的公式来计算木瓜蛋白酶的纯度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，苏赛男，聂华丽，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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