一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法技术

本发明专利技术旨在提出一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，包括血浆样品的预处理、色谱分离和质谱检测，本发明专利技术所述的检测方法节约了检测成本、提高了检测通量、适用于大批量样本检测。样本检测。样本检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法


[0001]本专利技术属于药物的生物分析领域，具体涉及一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法。

技术介绍

[0002]头孢克洛的作用机制是通过抑制细菌细胞壁的合成来发挥杀菌作用，研究其人体药动学行为时需要测定受试者或患者血浆中的头孢克洛浓度。
[0003]目前已经报道过的血浆中头孢克洛浓度的检测方法有微生物法，液质联用法、高效液相色谱法，但微生物法具有操作复杂、过程繁琐、灵敏度低等缺点，高效液相色谱法具有样品分析时间较长、灵敏度不稳定、样品前处理过程复杂等缺点，相对来说液质联用法具有较高的专属性、灵敏度和高通量的优点。而目前已经报道的液质联用法中或多或少存在血浆样品前处理步骤复杂、采用的血浆量较多、样品进样量较多、分析时间长等缺点，导致成本增加。
[0004]因此，为了支持头孢克洛的药动学研究，本领域需求一种更加经济、准确、快速和灵敏度高的血浆中头孢克洛浓度的检测方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：步骤一：血浆样品的预处理，将血浆样品加入至96孔板中，加入内标工作溶液，混匀，再加入甲醇溶液进行蛋白沉淀，混匀，离心，转移上清液至另一装有超纯水的96孔进样板中，封膜，涡旋混匀，进行液质联用分析；步骤二：色谱分离，色谱条件如下：自动进样器温度为5℃，柱温为40℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，运行时间3.7min，流速为0.35mL/min，进样量为2μL，洗脱梯度如下所示：；步骤三：质谱检测，电喷雾离子源，检测方式为正离子，源温度为500
°
C，监测模式为多重反应监测，气帘气体为35.0 psi，碰撞气体为8.0 psi，离子喷雾电压为5000.0 V，气
体1为50.0 psi，气体2为50.0 psi，扫描时间200ms，头孢克洛定量分析离子对368.1/174.1，去簇电压58.0V，碰撞能量20.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V，内标物定量分析离子对373.1/179.0，去簇电压60.0，碰撞能量21.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V。
[0007]在一些实施方式中，步骤一所述内标工作溶液为头孢克洛
‑
d5溶液。
[0008]在一些实施方式中，步骤一所述血浆样品、内标工作溶液与甲醇加入的体积比为8:5:30。
[0009]在一些实施方式中，步骤一所述血浆样品加入量为80
µ
L。
[0010]可以理解，在测定血浆中头孢克洛的浓度时一般血浆使用量为200μL，本专利技术所述方法的血浆使用量是较低的，节约了检测成本。
[0011]在一些实施方式中，步骤一所述血浆样品预处理方法为用移液器取80μL样品加入至96孔板中，加入50μL内标工作溶液，涡旋混匀1 min，加入300
ꢀµ
L甲醇进行蛋白沉淀，在96孔板混匀仪震摇3min使充分混匀，离心10min，转移上清液100μL至另一装有100μL纯化水的96孔进样板中，封膜，涡旋混匀3min。
[0012]在一些实施方式中，步骤二所述色谱分离使用的色谱柱为ACQUITY UPLC
®
HSS T3 1.8um2.1
×
75mm。
[0013]在一些实施方式中，血浆样品处理至进样全程，都添加了一定比例的甲酸，使头孢克洛化合物在检测全程处于酸性环境，并对验证了头孢克洛化合物在检测过程中的稳定性。
[0014]本专利技术另一方面提供一种更为具体的检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，包括以下步骤：步骤一：血浆样品的预处理，用移液器取80μL样品加入至96孔板中，加入50μL内标工作溶液，涡旋混匀1 min，加入300
ꢀµ
L甲醇进行蛋白沉淀，在96孔板混匀仪震摇3min使充分混匀，离心10min，转移上清液100μL至另一装有100μL纯化水的96孔进样板中，封膜，涡旋混匀3min；步骤二：色谱分离，色谱条件如下：色谱柱为ACQUITY UPLC
®
HSS T3 1.8um2.1
×
75mm，自动进样器温度为5℃，柱温为40℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，运行时间3.7min，流速为0.35mL/min，进样量为2μL，洗脱梯度如下所示：；步骤三：质谱检测，电喷雾离子源，检测方式为正离子，源温度为500
°
C，监测模式为多重反应监测，气帘气体为35.0 psi，碰撞气体为8.0 psi，离子喷雾电压为5000.0 V，气
体1为50.0psi，气体2为50.0psi，扫描时间200ms，头孢克洛定量分析离子对368.1/174.1，去簇电压58.0V，碰撞能量20.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V，内标物定量分析离子对373.1/179.0，去簇电压60.0，碰撞能量21.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V。
[0015]综上所述，本专利技术具有以下优势：本专利技术所述检测方法中血浆使用量为80μL、进样量为2μL，相对于现有技术血浆使用量和进样量较少，节约了检测成本；本专利技术所述检测方法中色谱分离运行时间为3.7min，提高了检测通量；本专利技术所述检测方法稳定可靠，适用于大批量样本检测。
附图说明
[0016]图1为头孢克洛离子扫描质谱图；图2为头孢克洛
‑
d5离子扫描质谱图；图3为空白血浆样品中头孢克洛（a）和头孢克洛
‑
d5(b)的MRM色谱图；图4为定量下限样品中头孢克洛（a）和头孢克洛
‑
d5(b)的MRM色谱图；图5为餐后口服受试制剂T和参比制剂R的头孢克洛平均血药浓度药时曲线图；图6为餐后口服受试制剂T和参比制剂R的头孢克洛平均血药浓度半对数图；图7为空腹口服受试制剂T和参比制剂R的头孢克洛平均血药浓度药时曲线图；图8为空腹口服受试制剂T和参比制剂R的头孢克洛平均血药浓度半对数图。
具体实施方式
[0017]为了便于理解，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。
[0018]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：血浆样品的预处理，将血浆样品加入至96孔板中，加入内标工作溶液，混匀，再加入甲醇溶液进行蛋白沉淀，混匀，离心，转移上清液至另一装有超纯水的96孔进样板中，封膜，涡旋混匀，进行液质联用分析；步骤二：色谱分离，色谱条件如下：自动进样器温度为5℃，柱温为40℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，运行时间3.7min，流速为0.35mL/min，进样量为2μL，洗脱梯度如下所示：，步骤三：质谱检测，电喷雾离子源，检测方式为正离子，源温度为500
°
C，监测模式为多重反应监测，气帘气体为35.0 psi，碰撞气体为8.0 psi，离子喷雾电压为5000.0 V，气体1为50.0 psi，气体2为50.0 psi，扫描时间200ms，头孢克洛定量分析离子对368.1/174.1，去簇电压58.0V，碰撞能量20.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V，内标物定量分析离子对373.1/179.0，去簇电压60.0，碰撞能量21.0eV，入口电压为10.0V，碰撞室出口电压15.0V。2.根据权利要求1所述的一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，其特征在于，步骤一所述内标工作溶液为头孢克洛
‑
d5溶液。3.根据权利要求1所述的一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，其特征在于，步骤一所述血浆样品、内标工作溶液与甲醇加入的体积比为8:5:30。4.根据权利要求3所述的一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，其特征在于，步骤一所述血浆样品加入量为80
µ
L。5.根据权利要求1所述的一种检测血浆中头孢克洛浓度的生物分析方法，其特征在于，步骤一所述血浆样品预处理方法为用移液器取80μL样品加入至96孔板中，加入50μL内标工作溶液，涡旋混匀1 min，加入300
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L甲醇进行蛋白沉淀，在96孔板混...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴慧慧，游宇，熊常枫，骆平英，
申请(专利权)人：湖南科锐斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：