一种同时检测4类17种热加工危害物的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种同时检测4类17种热加工危害物的方法，包括：在样品中加入正己烷，混匀后丢弃正己烷相，用二甲基酮和超声辅助提取丙烯酰胺、5

【技术实现步骤摘要】
spectrometry，UPLC
‑
MS/MS)同时检测4类17种热加工危害物的检测方法，具体包括丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛、13种杂环胺和2种晚期糖基化末端产物。
[0005]实现本专利技术上述目的的技术方案为：
[0006]一种同时检测4类17种热加工危害物的检测方法，所述4类17种热加工危害物包括：丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛、13种杂环胺：2
‑
氨基
‑3‑
甲基咪唑[4,5
‑
f]喹啉(IQ)、2
‑
氨基
‑
3,8
‑
二甲基咪唑[4,5
‑
f]喹啉(MeIQx)、1
‑
甲基
‑
9H
‑
吡啶[3,4
‑
b]吲哚(Harman)、9H
‑
吡啶[3,4
‑
b]吲哚(Norharman)、2
‑
氨基
‑
9H
‑
吡啶[2,3
‑
b]吲哚(AαC)、2
‑
氨基
‑3‑
甲基
‑
9H
‑
吡啶[2,3
‑
b]吲哚(MeAαC)、3
‑
氨基
‑
1,4
‑
二甲基
‑
5H
‑
吡啶[4,3
‑
b]吲哚乙酸酯(Trp
‑
P
‑
1)、3
‑
氨基
‑1‑
甲基
‑
5H
‑
吡啶[4,3
‑
b]吲哚乙酸酯(Trp
‑
P
‑
2)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基二吡啶并[1,2
‑
α:3'2'
‑
d]咪唑氢氯酸盐(Glu
‑
P
‑
1)、2
‑
氨基二吡啶并[1,2
‑
α:3'2'
‑
d]咪唑氢氯酸盐(Glu
‑
P
‑
2)、2
‑
氨基
‑1‑
甲基
‑6‑
苯咪唑[4,5
‑
b]吡啶(PhIP)、2
‑
氨基
‑
1,6
‑
二甲基咪唑[4,5
‑
b]吡啶(DMIP)、2
‑
氨基
‑5‑
苯基吡啶(Phe
‑
P
‑
1)、2种晚期糖基化末端产物：羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)，所述方法包括步骤：
[0007]S1：在样品中加入正己烷，涡旋混匀后超声处理，离心，丢弃正己烷相以除去脂质；加入二甲基酮，用超声辅助提取丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛和游离杂环胺，离心，收集二甲基酮层上清液，加入混合内部标准品溶液，净化干燥后，用初始流动相复溶；
[0008]S2：将步骤S1离心余下的沉淀物转移到另一管中，加入四氢硼酸钠还原；加入氢氯酸水解；水解产物中加入混合内部标准品溶液，通过固相萃取小柱(Oasis MCX)，用氨化甲醇洗脱，干燥后，用初始流动相复溶；
[0009]S3：配制一系列不同浓度的混合标准工作溶液，建立17种物质的标准曲线；步骤S1、步骤S2复溶得到的产物分别或混合后采用UPLC
‑
MS/MS分析，内部标准品法定量；
[0010]其中步骤S1复溶的产物用于检测丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛、13种杂环胺(AA、HMF和13种游离HAs)；步骤S2复溶的产物用于检测13种结合HAs和2种结合AGEs。
[0011]以下是本专利技术的优选技术方案。
[0012]步骤S1中，所述样品为待测的热加工食品样品，按每克样品加入10mL正己烷的比例，涡旋，超声5～15分钟，离心丢弃正己烷相，以除去脂质。
[0013]该步骤可重复三次。
[0014]步骤S1中，每克样品加入10mL二甲基酮并涡旋1～2分钟，采用超声辅助提取10～30分钟后，将混合物以5000～20000rpm连续离心5～20分钟。
[0015]步骤S1中，所述混合内部标准品溶液的终浓度为200～1000μg/L；加入的净化物质为无水硫酸镁(MgSO4)和N
‑
丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)。
[0016]可选地，所述混合内部标准品溶液加入体积为每克样品20μL，内部标准品溶液浓度为50mg/L 13
C3‑
AA、10mg/L 13
C6‑
HMF和10mg/L 4,7,8
‑
TriMeIQx。加入混合内部标准品溶液后用无水MgSO4和PSA净化。
[0017]加入AA、HMF和HAs对应的内部标准品
13
C3‑
AA、
13
C6‑
HMF和4,7,8
‑
TriMeIQx，有两点作用：其一是消除基质效应的干扰，减少掩蔽或增强效应，造成含量低估或高估；其二是校正前处理过程造成的损失，避免含量低估。
[0018]其中，无水MgSO4的作用是吸附样品中的水分，促进目标分析物转移至有机相，提高萃取效率；PSA的作用是吸附部分杂质，净化提取液。每克样品二者的加入量可分别为
4.0g和0.03g。
[0019]步骤S2中，将离心后余下的沉淀物转移到聚四氟乙烯管中用于结合态HAs和AGEs分析。本方法可以同步转化结合态HAs和AGEs，实现准确定量，减少前处理的时间成本和有机试剂的投入。
[0020]步骤S2中，还原操作为：用pH 9.2的硼酸盐缓冲液和1M四氢硼酸钠(0.1M氢氧化钠溶解)溶液处理10～15小时。还原溶液用氯仿
‑
甲醇混合溶液沉淀蛋白。
[0021]该还原步骤旨在减少果糖赖氨酸，从而避免其在酸水解过程中形成新的AGEs，造成含量高估。
[0022]具体可以采用如下操作：称量1g样品，在4℃下使用10mL硼酸盐缓冲液(0.2M，pH 9.2)和5mL四氢硼酸钠(1M，溶于0.1M氢氧化钠溶液)还原12小时。还原溶液优选用10mL氯仿
‑
甲醇(2:1，v/v)混合溶液沉淀蛋白。
[0023]步骤S2中，水解操作为：在6M氢氯酸中水解20～28小时。冷却至室温后，过滤蛋白水解产物并用超纯水稀释。
[0024]更优选地，采用的水解条件是加入10mL 6M氢氯酸，在110℃水解24小时。
[0025]所述固相萃取小柱，可以是Oasis MCX，或本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测4类17种热加工危害物的方法，其特征在于，所述4类17种热加工危害物包括：丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛、13种杂环胺：2
‑
氨基
‑3‑
甲基咪唑[4,5
‑
f]喹啉(IQ)、2
‑
氨基
‑
3,8
‑
二甲基咪唑[4,5
‑
f]喹啉(MeIQx)、1
‑
甲基
‑
9H
‑
吡啶[3,4
‑
b]吲哚(Harman)、9H
‑
吡啶[3,4
‑
b]吲哚(Norharman)、2
‑
氨基
‑
9H
‑
吡啶[2,3
‑
b]吲哚(AαC)、2
‑
氨基
‑3‑
甲基
‑
9H
‑
吡啶[2,3
‑
b]吲哚(MeAαC)、3
‑
氨基
‑
1,4
‑
二甲基
‑
5H
‑
吡啶[4,3
‑
b]吲哚乙酸酯(Trp
‑
P
‑
1)、3
‑
氨基
‑1‑
甲基
‑
5H
‑
吡啶[4,3
‑
b]吲哚乙酸酯(Trp
‑
P
‑
2)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基二吡啶并[1,2
‑
α:3'2'
‑
d]咪唑氢氯酸盐(Glu
‑
P
‑
1)、2
‑
氨基二吡啶并[1,2
‑
α:3'2'
‑
d]咪唑氢氯酸盐(Glu
‑
P
‑
2)、2
‑
氨基
‑1‑
甲基
‑6‑
苯咪唑[4,5
‑
b]吡啶(PhIP)、2
‑
氨基
‑
1,6
‑
二甲基咪唑[4,5
‑
b]吡啶(DMIP)、2
‑
氨基
‑5‑
苯基吡啶(Phe
‑
P
‑
1)、2种晚期糖基化末端产物：羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)；所述方法包括如下步骤：S1：在样品中加入正己烷，涡旋混匀后超声处理，离心，丢弃正己烷相以除去脂质；加入二甲基酮，用超声辅助提取丙烯酰胺、5
‑
羟甲基糠醛和游离杂环胺，离心，收集二甲基酮层上清液，加入混合内部标准品溶液，净化干燥后，用初始流动相复溶；S2：将步骤S1离心后余下的沉淀物转移到另一管中，加入四氢硼酸钠还原；加入氢氯酸水解；水解产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雨辰，魏思宇，陈芳，杨馨，孙国玉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：