一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，细胞穿透抗菌肽PW2的序列如SEQ ID No.1所示；合成方法示意如下：通过成对Trp

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种细胞穿透抗菌肽PW2及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞内感染是慢性疾病的代表性杀手，病原体潜入细胞内可逃避机体免疫防御和清除的一系列作用，通常对宿主细胞毒性较低，以保证其长期隐匿于细胞内，因此在机体内不断生长和繁殖，并可在畜禽动物之间水平传播，在适当时机或当畜禽免疫力减弱时便发作，严重时可危及生命。细胞内感染病原体对畜牧生产造成了严重的危害，例如，无乳链球菌侵袭奶牛乳腺细胞后会造成奶牛泌乳量下降、乳品质降低等危害。猪伤寒沙门氏菌侵袭断奶仔猪肠道上皮细胞也会导致仔猪免疫力下降、降低采食量和生长性能。因此，解决细胞内感染在畜牧兽医领域具有极为广阔的市场应用前景。
[0003]虽然青霉素在目前是一种极为有效的抗感染药物，但是青霉素无法转导进入细胞内部来清除胞内细菌。此外，随着农业农村部194号公告的颁布，饲料中已全面禁用饲用抗生素。因此，迫切寻找一种能够清除胞内细菌的生物分子。抗菌肽是生物体内广泛存在的具有抗菌活性的小分子多肽，对真菌、病毒、寄生虫和癌细胞也具有杀伤作用。现需要一种能够清除细胞内细菌的高效细胞穿透抗菌肽，为饲用型抗菌肽的研发提供理论基础和技术支持。

技术实现思路

[0004]基于以上问题，本专利技术的目的在于公开一种细胞穿透抗菌肽PW2，该抗菌肽PW2是一种衍生自HIV的细胞穿透肽TAT和抗菌肽杂合形成的细胞穿透抗菌肽，其目的是能够穿透哺乳动物细胞并清除胞内病原体，克服青霉素无法解决的胞内感染的难题，使其拥有成为抗生素替代物的潜力。
[0005]本专利技术的目的是这样实现的：一种细胞穿透抗菌肽PW2，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其C端酰胺化。
[0006]本专利技术的另一目的是提供如上所述的一种细胞穿透抗菌肽PW2的制备方法，如下：通过成对Trp
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Trp基序与Pro排列来促进细胞穿透抗菌肽的抗菌活性，其序列为PWWPPWWP；衍生自HIV的细胞穿透肽TAT的氨基酸序列为RKKRRQRRR；两者通过三甘氨酸连接体GGG相连；采用固相化学合成法得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽，其序列如SEQ ID No.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备；再经过抗菌活性检测、溶血活性的测定、细胞内杀菌能力的测定，最后命名为细胞穿透抗菌肽PW2。
[0007]本专利技术的另一目的是提供如上所述的一种细胞穿透抗菌肽PW2在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染性的疾病的药物中的应用。
[0008]进一步的，如上所述的应用，所述的抗菌肽PW2能够杀灭细胞内的金黄色葡萄球
菌。
[0009]进一步的，如上所述的应用，所述的抗菌肽PW2能够杀灭小鼠巨噬细胞RAW264.7内的金黄色葡萄球菌。
[0010]本专利技术的有益效果及优点如下：本专利技术杂合了细胞穿透肽TAT和抗菌肽，对形成的细胞穿透抗菌肽PW2进行生物学活性检测，发现其不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等6种菌种有高效的抑制作用，而且具备较低的溶血毒性，该细胞穿透抗菌肽在128μM的浓度下仅造成2.16％的红细胞溶血。另外，该细胞穿透抗菌肽具有杀灭小鼠巨噬细胞RAW264.7内金黄色葡萄球菌的能力，而青霉素无法杀灭胞内细菌，其已具备成为抗生素替代物和饲用型细胞穿透抗菌肽的发展潜力。
附图说明
[0011]图1为本专利技术的细胞穿透抗菌肽PW2的高效液相色谱图。
[0012]图2为本专利技术的细胞穿透抗菌肽PW2的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图。
[0013]图3为本专利技术的细胞穿透抗菌肽PW2和蜂毒素ME的溶血活性图。
[0014]图4为本专利技术的细胞穿透抗菌肽PW2和青霉素的细胞内杀菌图。
具体实施方式
[0015]下面根据说明书附图举例对本专利技术做进一步的说明:
[0016]实施例1
[0017]细胞穿透抗菌肽的设计
[0018]以成对Trp
‑
Trp基序与Pro的排列，即PWWPPWWP的多肽，以及衍生自HIV的TAT，即RKKRRQRRR为细胞穿透肽，杂合得到细胞穿透抗菌肽，命名为PW2。细胞穿透抗菌肽的序列如表1所示。
[0019]表1细胞穿透抗菌肽的氨基酸序列。
[0020][0021]PW2的正电荷数为+9，疏水值为0.181。该细胞穿透抗菌肽不仅可以抑制多种病原微生物的生长，而且对人血红细胞没有毒性。重要的是，该细胞穿透抗菌肽能够杀灭侵染进入小鼠巨噬细胞RAW264.7的金黄色葡萄球菌，具有开发为抗生素替代物的潜力。
[0022]实施例2：
[0023]固相化学合成法合成细胞穿透抗菌肽
[0024]1、细胞穿透抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
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X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
‑
Wang树脂；再将Fmoc
‑
Y
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Trt
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OH(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
‑
Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0025]2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水
乙醚，
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20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0026]3、使用0.2M的硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
[0027]4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
[0028]实施例3：
[0029]1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定细胞穿透抗菌肽PW2和蜂毒素ME的最小抑菌浓度。以2mg/ml的BSA(含0.01％乙酸)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿透抗菌肽PW2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其C端酰胺化。2.根据权利要求1所述的一种细胞穿透抗菌肽PW2的制备方法，其特征在于，方法如下：通过成对Trp
‑
Trp基序与Pro排列来促进细胞穿透抗菌肽的抗菌活性，其序列为PWWPPWWP；衍生自HIV的细胞穿透肽TAT的氨基酸序列为RKKRRQRRR；两者通过三甘氨酸连接体GGG相连；采用固相化学合成法得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽，其序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：董娜，方禹鑫，赵璐，隋明瑞，姜乾智，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：