一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，所述耐热纤维素酶为耐热纤维素酶Cel12E。在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。切割效率高。切割效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，属于生物

[0002]背景研究
[0003]黄原胶又称黄胶、汉生胶，是一种由纯培养的野油菜黄单孢菌分泌到胞外的水溶性多糖。黄原胶酶水解黄原胶生成的黄原胶寡糖，是一种潜在的可商业化的功能性寡糖。黄原胶寡糖具有清除羟基自由基的功能，激活因子的活性，以及抑菌活性。同时，黄原胶寡糖在农业、食品、医药等方面具有广泛的应用。
[0004]降解黄原胶的方法包括物理法、化学法、生物法。物理法降解黄原胶需要较多的仪器设备。化学法降解黄原胶会对破坏黄原胶的活性基团，对环境也有影响。生物法是一种对环境友好的方法，绿色环保。
[0005]黄原胶主链与纤维素相似，由β
‑
1,4糖苷键相连的葡萄糖构成，侧链由甘露糖、葡萄糖、甘露糖三个相连的单糖构成。黄原胶的二级结构是侧链绕主链骨架反向缠绕，通过氢键维系形成棒状双螺旋结构，具有极强的稳定性。在常温条件下，黄原胶的结构非常的致密，酶的可及性低。在高温的条件下，黄原胶的结构会发生变化，会从有序的双螺旋构象变为单螺旋构象，酶的可及性提高，更有利于水解黄原胶。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了高效制备黄原胶寡糖，利用耐热纤维素酶切割黄原胶。在高温条件下，黄原胶的结构变的疏散，提高酶对黄原胶的切割效率，生成更多的黄原胶寡糖。同时，高温条件更有利于工业生产。
[0007]本专利技术发现了一种耐高温的纤维素酶Cel12E，在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶的酶活为568
±
1.69U/g，是常温黄原胶酶Mixen的9倍，是耐热纤维素酶Cel8A的5.6倍，如图2所示。
[0008]本专利技术发现的耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶的最适温度为90℃，温度稳定的范围非常广泛，在90℃的条件下有80％以上的活性，如图3所示。本专利技术发现的耐热纤维素酶Cel12E降解黄原胶生成的黄原胶寡糖含量较高，如图6所示。
附图说明
[0009]图1是本专利技术的耐热纤维素酶Cel12E的SDS
‑
PAGE电泳图，其中泳道1为空载，泳道2位粗酶液，泳道3为纯化后的Cel12E，M为Marker蛋白。
[0010]图2是黄原胶酶Mixen、耐热纤维素酶Cel8A、耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶的酶活对比图。
[0011]图3是耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0012]图4是黄原胶酶Mixen作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0013]图5是耐热纤维素酶Cel8A作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。
[0014]图6是原始黄原胶，黄原胶酶Mixen、耐热纤维素酶Cel8A、耐热纤维素酶Cel12E降解黄原胶生成黄原胶寡糖的液相色谱图。
[0015]在高温条件下，耐热纤维素酶Cel12E能有效的切割黄原胶，切割效率高。
具体实施方式
[0016]下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。
[0017]实施例1：
[0018]一种利用耐热纤维素酶Cel12E降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：
[0019](1)通过基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成了含有耐热纤维素酶Cel12E的甘油菌，耐热纤维素酶Cel12E的基因序列来源于文献(Benedikt L,Simon H,Angel A,et al.Functional Screening of Hydrolytic Activities Reveals an Extremely Thermostable Cellulase from a Deep
‑
Sea Archaeon[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2015,3.)，将含有耐热纤维素酶Cel12E的基因片段导入大肠杆菌中；
[0020](2)培养含有耐热纤维素酶基因的大肠杆菌；
[0021](3)将步骤(2)所得的大肠杆菌菌液离心弃上清，保留沉淀菌体，沉淀菌体依次用去离子水和缓冲液清洗，利用细胞破碎仪破碎菌体，破碎后离心取上清，上清即为耐热纤维素酶Cel12E的粗酶液；
[0022](4)将步骤(3)所得的粗酶液进行Ni柱(生工生物工程(上海)股份有限公司家的6mL的Ni
‑
NTA6FF琼脂糖纯化树脂填料)结合并纯化，最终得到纯化的耐热纤维素酶Cel12E；
[0023](5)将步骤(4)所得的纯化后的蛋白透析到缓冲溶液中；
[0024](6)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶底物，检测酶活；
[0025](7)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶Cel12E作用于黄原胶底物，进行最适温度、温度稳定性的测定；
[0026](8)在步骤(7)的条件下，将耐热纤维素酶Cel12E与黄原胶底物反应一段时间，将反应液煮沸，离心取上清，上清即为黄原胶寡糖；
[0027](9)将步骤(8)得到的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析。
[0028]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中耐热纤维素酶Cel12E导入大肠杆菌的方法包括如下步骤：
[0029]a、将全基因合成的甘油菌在含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板中进行划线，放在37℃培养箱中，培养12h；
[0030]b、先在10mL LB(于水中的质量浓度：0.5％ NaCl 1％蛋白胨1％酵母浸粉)液体培养基中加入10μL终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，再挑单菌落到液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养12h；
[0031]c、质粒提取：1)在室温下，取8mL过夜培养的菌液，在8,000g，2min条件下进行离心，倒掉上清；2)在沉淀中加入250μL Buffer P1(来自生工生物工程(上海)股份有限公司
质粒提取试剂盒，B518191，100次)，悬浮菌体；3)加入250μL Buffer P2(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，100次)，立即温和颠倒离心管混匀，室温静置2min，使细胞裂解完全；4)加入350μL Buffer P3(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，B518191，100次)，轻柔地上下颠倒混匀，液体呈现白色絮状，12,000g，10min离心，；5)将上清液用移液枪吸入到质粒提取柱(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，B518191，100次)，8,000g，离心30s，倒掉收集的液体；6)向质粒提取柱中加入500μL Wash buffer(来自生工生物工程(上海)股本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，其特征在于：所述耐热纤维素酶为耐热纤维素酶Cel12E。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：于黄原胶水溶液中加入耐热纤维素酶进行黄原胶降解制备黄原胶寡糖；其降解条件为：温度30
‑
100℃，优选温度50
‑
90℃，更优选80
‑
90℃；时间10
‑
30min，优选时间15
‑
25min，更优选20
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，张丽伟，李宪臻，
申请(专利权)人：李宪臻，
类型：发明
国别省市：