梨PbELF4-like1基因及其编码的蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了梨PbELF4

【技术实现步骤摘要】
梨PbELF4
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like1基因及其编码的蛋白和应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及梨PbELF4
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like1基因及其编码的蛋白和应用。

技术介绍

[0002]梨(Pyrus L.)是我国第三大果树，栽培历史悠久，资源丰富，面积和产量均位于世界首位。开花是果树一种重要的园艺性状，会极大地影响果树的产量和果实的品质。因此，开展梨开花相关基因的挖掘和研究，对于调控花期、提高产量以及新品种培育等都有重要意义。
[0003]高等植物由营养生长向生殖生长转变的过程称为开花诱导，由遗传和外界环境两个因素决定，受错综复杂的网络信号途径调控。已探明调控植物开花的信号途径主要包括光周期、环境温度、春化、赤霉素、年龄和自主途径。光周期途径将各种外部信号整合至由生物钟调控的内源计时机制中，使植物能够精确地测量周围环境的光周期变化，进而启动或者抑制开花的过程。植物的叶片通过不同的光受体接受环境光信号后，传递至生物钟系统，由生物钟基因产生节律，并将节律输出给下游基因，从而调控下游开花相关基因的表达。模式植物拟南芥中已描述了现有较为完整的生物钟模型，该模型主要是由反馈调节循环构成，包括一个由三个连续负反馈组成的循环：LHY/CCA1在深夜增加对晚间复合体基因(ELF3、LUX和ELF4)的抑制，晚间复合体在夜间对PRR基因的抑制，以及PRRs在白天对LHY/CCA1的抑制。此外，LHY/CCA1抑制TOC1和GI在白天的表达，GI通过抑制晚间复合体基因来增加TOC1的表达等等。这些基因都参与了光周期信号途径，在昼夜变化中它们的表达量均发生变化，最终调控关键基因CO的表达。
[0004]ELF4基因在光周期感知、昼夜节律调控和开花信号整合中发挥关键作用。ELF4基因是通过反向遗传筛选开花时间突变体获得的。elf4突变体表现为下胚轴和叶柄较长，开花时间较早，同时伴随着开花激活因子CO的异常。进一步研究表明，ELF4通过与GI相互作用将GI从核质中隔离出来，阻碍GI与CO启动子的结合，从而改变开花时间。拟南芥ELF4蛋白含有111个氨基酸，不包含任何已知的蛋白质特征，该蛋白属于DUF1313家族，该家族成员共享一个仅在植物中发现的未知功能域(DUF1313)。除拟南芥外，在大豆、兰花、龙眼等植物中已克隆ELF4同源基因，并对其功能进行了研究。在龙眼中克隆获得DlELF4
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1和DlELF4
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2，它们分别与拟南芥中ELF4和ELF4
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like1相似度较高。通过异源转化拟南芥发现，两者的转基因植株都表现出延迟开花和不定根生长。大豆中获得9个GmELF4
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like候选基因，其中与AtELF4同源性最高的命名为GmELF4，GmELF4在拟南芥中的过表达延迟了开花。以上结果表明ELF4及其同源基因参与植物开花调控过程。
[0005]目前有关梨中PbELF4
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like基因的功能及其在调控开花中的作用还未有报道，鉴于生物钟基因ELF4及ELF4
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like在其他物种中的调控作用，利用分子生物学方法研究梨中PbELF4
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like基因的特征及功能，对于调控梨成花、提高梨产量和品质具有重要意义和实际应用价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种具有调控植物开花功能的梨PbELF4
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like1基因及其编码的蛋白和应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]一种梨PbELF4
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like1基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]上述的梨PbELF4
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like1基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]用于克隆上述梨PbELF4
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like1基因的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
[0011]含有上述梨PbELF4
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like1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或载体工程菌。
[0012]上述的梨PbELF4
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like1基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或载体工程菌在延迟开花的植物育种中的应用。
[0013]上述的梨PbELF4
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like1基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或载体工程菌在调控植物开花方面的应用。上述的应用，优选的，将所述的梨PbELF4
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like1基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物延迟开花。
[0014]一种使植物延迟开花的方法，将上述的梨PbELF4
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like1基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述的植物延迟开花。
[0015]本专利技术以拟南芥ELF4及ELF4
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like1/2/3/4蛋白序列为参考，筛选获得梨数据库中同源性较高的PbELF4
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like备选蛋白，根据系统进化树将NCBI中XP_009371495蛋白命名为PbELF4
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like1。设计PbELF4
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like1基因特异性引物(序列见SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9)，以梨叶片的cDNA为模板克隆得到PbELF4
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like1基因的CDS(coding sequence)全长序列435bp(序列见SEQ ID NO.2)，编码145个氨基酸的蛋白质(序列见SEQ IDNO.1)，含有保守的DUF1313结构域。
[0016]利用荧光定量PCR技术对PbELF4
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like1基因在梨不同组织和昼夜变化处理下叶片中的表达情况进行分析，结果表明：该基因在不同组织中均有一定的表达，其中在花芽和花药中的表达量相对较高，而在花瓣和子房中的表达量相对较低；此外，该基因在一天中均有表达，但表达水平先下降再上升又下降，在一天不同时间点表现出明显的波动变化趋势。
[0017]将PbELF4
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like1基因的CDS全长序列构建于过表达载体pCAMBIA1300
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35S:GFP。构建好的重组表达载体利用农杆菌浸花法转化野生型拟南芥(Col
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0)，经过潮霉素抗性筛选获得转基因阳性苗。在长日照条件下，与对照植株相比，PbELF4
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like1转基因株系开花时间显著延迟，而且莲座叶数显著增加。结果表明，梨PbELF4
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like1基因在调控植物开花方面发挥作用。
[0018]更详细的技术方案参见具体实施方式。
[0019]序列表SEQ ID NO.1是本专利技术克隆的梨PbELF4...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种梨PbELF4
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like1基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述的梨PbELF4
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like1基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。3.用于克隆权利要求1所述梨PbELF4
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like1基因的引物对，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。4.含有权利要求1所述梨PbELF4
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like1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或载体工程菌。5.权利要求1中所述的梨PbELF4
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like1基因、权利要求2中所述的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴巨友，王鹏，刘哲，柳维娟，齐开杰，谢智华，张绍铃，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：