一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用技术

本申请涉及免疫学的技术领域，具体公开了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用，所述单链抗体包括包含重链可变区和轻链可变区，以及用于连接所述重链可变区和所述轻链可变区的柔性连接肽；所述重链可变区的互补决定区具有如SEQ ID No.1～3所示的片段，所述轻链可变区的互补决定区具有如SEQ ID No.4～6所示的片段。本申请所述单链抗体具有较高的灵敏度和特异性，且检测限低至50pg/mL，可应用于实际样本的检测中。用于实际样本的检测中。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用


[0001]本申请属于基因工程抗体
，具体涉及一种用于检测Tau蛋白的单链抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是中枢神经系统进行性退行性疾病，是引起痴呆的最常见原因，因此又称老年痴呆病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，从病理改变到出现明显症状可经历数十年，最终导致认知功能障碍。阿尔茨海默病两大典型的病理改变包括：细胞内淀粉样斑块(AmyloidPlaques)形成和细胞外神经原纤维缠结(NeurofibrillaryTangles，NFTs)，进而出现突触丧失，神经元死亡。淀粉样斑块的主要组成成分为β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)，引起NFTs的主要成分为异常Tau蛋白。针对Aβ的药物(Aβ疫苗、γ分泌酶抑制剂)在临床研究中多数已宣告失败，而且越来越多的研究指向Tau蛋白过度磷酸化才是阿尔茨海默病产生神经毒性的直接原因，Tau蛋白过度磷酸化后与微管蛋白的结合力仅是正常Tau蛋白的1/10，失去了其促进微管装配形成的生物学功能并丧失维持微管稳定的作用，引起神经元微管结构广泛破坏，正常轴突转运受损，最终导致突触丢失，神经元功能损伤，发生脑神经退行性病变。因此，Tau蛋白成为阿尔茨海默病最有希望的治疗靶点。
[0003]随着基因工程技术的发展，治疗性抗体药物逐渐占据全球市场，抗Tau蛋白单克隆抗体及基因工程抗体的研制是Tau蛋白靶向诊治方向之一，可为阿尔茨海默病人的诊断和治疗奠定一定的技术和物质基础。
[0004]免疫球蛋白(Ig)或抗体是免疫系统的重要组成部分，根据结构它们扮演了双重角色。它们一方面能够通过抗原结合片段位点特异性结合抗原，另一方面可通过Fc段激活免疫系统其他细胞介导免疫反应。它们可分为多克隆抗体(多种抗体能识别抗原多个表位)和单克隆抗体(mAbs)。后者是高度特异性的抗体，只能识别抗原的某一特定表位，被广泛应用于免疫组化、流式细胞、免疫印迹及相关技术中。除此以外，在最近的20年里，单抗也成为癌症治疗的重要组成部分。它们的医疗应用可以扩展到慢性炎症疾病、移植和感染中(例如HIV单抗在治疗人类HIV疾病中效果显著)。
[0005]单克隆抗体(MAb)虽然具有特异性强和亲和力高的优点，但其现有生产技术存在生产成本高、规模难于工业放大和质控等缺点，基因工程小分子抗体是单克隆抗体的理想替代产品。重组抗体是继多抗和单抗后的第三代抗体，其利用重组DNA技术改造抗体的基因结构，然后将重组抗体基因转入原核或真核表达系统中表达，形成了重组抗体。与多抗和单抗的制备相比，重组抗体技术具有以下特点和优势：
①
不需要免疫动物；
②
抗体工程菌比杂交瘤细胞稳定，易保存，适于大规模工业化生产；
③
可获得高亲合力的特异性抗体。其中单链抗体(Singlechainvatiablefragment,ScFv)具有分子量小、组织穿透力强、体内循环半衰期短、免疫原性低、易于进行基因工程改进等优点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用。目前，还未见有针对Tau蛋白的重组单链抗体的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种针对Tau蛋白N端区域的重组单链抗体，以及该重组单链抗体的制备方法和应用。该单链抗体可对Tau蛋白进行高特异性、高灵敏度、高准确性检测。
[0007]申请人以Tau蛋白N端区域的氨基酸序列(SEQ ID No.14)与BSA(牛血清白蛋白)偶联形成免疫复合物，并利用该BSA
‑
多肽(免疫原)对动物进行免疫制备交瘤细胞，通过间接ELISA法筛选能够分泌识别Tau蛋白N端区域的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并分析与Tau蛋白N端区域多肽(SEQ ID No.14)的亲和性，得到了一株与所述Tau蛋白N端区域多肽具有较强结合力的杂交瘤细胞株，对该杂交瘤细胞株进行抗体序列的测定及分析，设计重组质粒，经大肠杆菌杆菌周质腔表达，最终得到了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体。
[0008]作为本申请的第一个实施方案，提供了一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，所述单链抗体包括包含重链可变区V
H
和轻链可变区V
L
，以及用于连接所述重链可变区V
H
和所述轻链可变区V
L
的柔性连接肽；
[0009]所述重链可变区V
H
的互补决定区具有CDR1
H
、CDR2
H
和CDR3
H
的片段，所述CDR1
H
、CDR2
H
和CDR3
H
的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1～3所示；
[0010]所述轻链可变区V
L
的互补决定区具有CDR1
L
、CDR2
L
和CDR3
L
的片段，所述CDR1
L
、CDR2
L
和CDR3
L
的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4～6所示。
[0011]在本实施方案中，所述重链可变区V
H
的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示。
[0012]在本实施方案中，所述轻链可变区V
L
的氨基酸序列优选如SEQ ID No.8所示。
[0013]在本实施方案中，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)
n
所示的肽链，其中，n为整数。
[0014]优选的，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。
[0015]在本实施方案中，所述重链可变区V
H
的N端通过柔性连接肽与所述轻链可变区V
L
的C端相连；或所述所述轻链可变区V
L
的N端通过柔性连接肽与所述重链可变区V
H
的C端相连。
[0016]在本实施方案中，所述单链抗体按照轻链可变区V
L
‑
柔性连接肽
‑
重链可变区V
H
的顺序构成，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
[0017]作为本申请的第二个实施方案，提供了一种DNA分子，所述DNA分子编码上述所述单链抗体。
[0018]作为本申请的第三个实施方案，提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含上述所述CDR1
H
、CDR2
H
和CDR3
H
的片段，以及所述CDR1
L
、CDR2
L
和CDR3
L
的片段。
[0019]优选的，所述重组质粒包含氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的所述重链可变区V
H
和氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的轻链可变区V
L
。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体包括包含重链可变区V
H
和轻链可变区V
L
，以及用于连接所述重链可变区V
H
和所述轻链可变区V
L
的柔性连接肽；所述重链可变区V
H
的互补决定区具有CDR1
H
、CDR2
H
和CDR3
H
的片段，所述CDR1
H
、CDR2
H
和CDR3
H
的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1～3所示；所述轻链可变区V
L
的互补决定区具有CDR1
L
、CDR2
L
和CDR3
L
的片段，所述CDR1
L
、CDR2
L
和CDR3
L
的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.4～6所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述重链可变区V
H
的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示；所述轻链可变区V
L
的氨基酸序列优选如SEQ ID No.8所示。3.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述柔性连接肽为氨基酸序列(G4S)3所示的肽链。4.根据权利要求1所述的一种用于检测Tau蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体按照轻链可变区V
L
‑
柔性连接肽
‑
重链可变区V
H
的顺序构成，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。5.一种DNA分子，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍波，沈晨光，周妮娜，孙志华，蒋宇珊，董晓宁，尹美移，吴智广，李超辉，
申请(专利权)人：天津鸿宇泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：