一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A及乙酰辅酶A衍生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，发酵过程中，醛缩酶将苏氨酸分解为甘氨酸和乙醛。本发明专利技术还公开了一种同时制备甘氨酸和乙酰辅酶A的方法，发酵过程中，乙酰化乙醛脱氢酶将乙醛还原为乙酰辅酶A或乙酰辅酶A衍生物；或苏氨酸脱氢酶将苏氨酸脱氢得到2

【技术实现步骤摘要】
一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A及乙酰辅酶A衍生物的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和发酵工程
，具体涉及一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A及乙酰辅酶A衍生物的方法。

技术介绍

[0002]乙酰辅酶A(Acetyl
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coA)由辅酶A(CoA)和乙酸以硫酯键连接而成，是细胞代谢的重要中间代谢产物之一，参与多种细胞生命过程。Acetyl
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coA由糖、脂肪、氨基酸等分解代谢产生，最终通过三羧酸循环和氧化磷酸化，彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用以ATP的合成。此外，它还可以作为许多重要生物大分子的前体，包括脂肪酸、1
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丁醇、聚羟基烷酸、聚酮酸和异戊二烯类等，其中脂肪酸可用于膳食补充剂、药物和生物柴油等，聚酮酸可用于制药，异戊二烯类可用于制备香精、香料、生物燃料、膳食补充剂、维生素和药物等。然而，这些重要的生物大分子的有效生物合成往往受到Acetyl
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coA供应不足的阻碍，因此如何提高Acetyl
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coA的产量保证供应极为重要。
[0003]在有氧条件下，糖酵解产生丙酮酸经脱羧是合成Acetyl
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coA的一个主要途径；此外外源脂肪酸通过β
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氧化不断缩短碳链，最终形成Acetyl
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coA；或者某些氨基酸代谢也是提供Acetyl
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coA的途径之一。在大肠杆菌等微生物中，提高Acetyl
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coA产量最直接方法之一是通过过表达Acetyl
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coA合成酶和敲除竞争路径实现，利用多种基因的过表达以及代谢路径的优化，可以合成Acetyl
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coA的多种衍生物如萜类、1
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丁醇、聚羟基烷酸等。Kang Zhou等在大肠杆菌中利用Dickeya zeae的乙酰化乙醛脱氢酶(ada)、Saccharomyces cerevisiae的乙醇脱氢酶(adh2)在不消耗ATP的情况下将乙醇转化为Acetyl
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coA，并以此为平台合成PHB，产量为1.1g/L。Javier Cardenas等通过阻断戊糖磷酸途径，并修饰大肠杆菌中的丙酮酸脱氢酶加强Acetyl
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coA以及NADPH/NADP+的合成，并以此提高了聚酮化合物的产量，达到1.6g/L。Menghao Cai等利用短而强的乙醇同化途径，在Crabtree
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negative yeast直接产生乙酰辅酶A，该方法可用于合成Acetyl
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coA的衍生药物莫纳克林，产率达2g/L。然而，目前来说，通过微生物代谢工程提高细菌内Acetyl
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coA的方法相对单一，而且转化效率普遍较低，耗时较长且产量不高，无法真正从工业量级上克服由于Acetyl
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coA供应不足导致的许多重要大分子合成产量受限的问题，亟待改进。
[0004]甘氨酸是化工、医药、农药等行业的重要原料，产量大、用途广。目前生产甘氨酸的方法大都采用α
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氯乙酸或Strecker法制备甘氨酸。专利CN101270061以氯乙酸、氨为原料，在乌洛托品和有机胺存在下也可以分离出含量较高的甘氨酸，但为了回收利用母液中的有效成分需要消耗大量的醇钠或醇钾，经济价值低，同时过量的醇需要回收将导致能耗的升高和投资的增加，并且产生了盐泥，后续处理较为麻烦。因此，本专利技术旨在开发一种联产甘氨酸和Acetyl
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coA或Acetyl
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coA衍生物的方法，以更好地满足实际需要。

技术实现思路

[0005]本专利技术所解决的技术问题在于提供一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A及乙酰辅酶A衍生物的方法，以提高甘氨酸和乙酰辅酶A或乙酰辅酶A衍生物的产量及转化率，更适于工业化生产。
[0006]本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
[0007]一种利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，以苏氨酸为底物、加入含有醛缩酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸分解为甘氨酸和乙醛。
[0008]进一步地，所述醛缩酶基因为苏氨酸缩醛酶基因或苯丝氨酸醛缩酶基因，包括ItaE、TdcB、glyA、Sdsl、bhcC、psald、pdxA或vrtJ中的一种或几种。优选为上述酶基因种类，本专利技术亦可采用其它具有同样功能的酶基因。
[0009]进一步地，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。
[0010]进一步地，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得醛缩酶编码基因，将获得的基因连接至质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微生物中即得到重组微生物。
[0011]进一步地，所述质粒为pZAlac、pZElac中的一种或两种，感受态细胞为E.coli dh5a感受态细胞。
[0012]进一步地，重组表达质粒载体为pZE
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ItaE，质粒pZE
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ItaE构建方法为：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组为模板通过PCR扩增得ItaE基因，将ItaE基因连接至含有IPTG诱导型启动子的pZElac载体上并转化至大肠杆菌E.coli dh5a感受态细胞中，测序后得到质粒pZE
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ItaE。
[0013]进一步地，发酵过程中，将重组微生物的菌种接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2
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xyT培养基中，培养3
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6h后加入IPTG至终浓度0.2～0.4mM，继续培养15～30h，离心得到菌液；将菌液加入Tris
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HCl缓冲液中，以15～30g/L的量加入苏氨酸作为底物，发酵得到含甘氨酸和乙醛的发酵液。
[0014]一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A的方法，以苏氨酸为底物，加入含有醛缩酶基因和乙酰化乙醛脱氢酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸分解为甘氨酸和乙醛，乙醛直接转化为乙酰辅酶A或乙醛转化为乙酸再转化成乙酰辅酶A；
[0015]或以苏氨酸为底物，加入含有苏氨酸脱氢酶基因和2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸脱氢得到2
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氨
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3酮丁酸，2
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氨
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3酮丁酸在2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶的作用下得到乙酰辅酶A。
[0016]进一步地，所述醛缩酶基因包括ItaE、TdcB、glyA、Sdsl、bhcC、psald、pdxA或vrtJ中的一种或几种；所述乙酰化乙醛脱氢酶基因包括eutE、bphJ、TTHB247、mhpF、ADH2或hsaG中的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，以苏氨酸为底物、加入含有醛缩酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸分解为甘氨酸和乙醛。2.根据权利要求1所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，所述醛缩酶基因包括苏氨酸缩醛酶基因或苯丝氨酸醛缩酶基因，苏氨酸缩醛酶基因或苯丝氨酸醛缩酶基因包括ItaE、TdcB、glyA、Sdsl、bhcC、psald、pdxA或vrtJ中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。4.根据权利要求3所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得醛缩酶编码基因，将获得的基因连接至质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微生物中即得到重组微生物。5.根据权利要求4所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，所述质粒为pZAlac、pZElac中的一种或两种，感受态细胞为E.coli dh5a感受态细胞。6.根据权利要求4所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，重组表达质粒载体为pZE
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ItaE，质粒pZE
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ItaE构建方法为：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组为模板通过PCR扩增得ItaE基因，将ItaE基因连接至含有IPTG诱导型启动子的pZElac载体上并转化至大肠杆菌E.coli dh5a感受态细胞中，测序后得到质粒pZE
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ItaE。7.根据权利要求1所述的利用苏氨酸制备甘氨酸的方法，其特征在于，发酵过程中，将重组微生物的菌种接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2
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xyT培养基中，培养3
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6h后加入IPTG至终浓度0.2～0.4mM，继续培养15～30h，离心得到菌液；将菌液加入Tris
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HCl缓冲液中，以15～30g/L的量加入苏氨酸作为底物，发酵得到含甘氨酸和乙醛的发酵液。8.一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A的方法，其特征在于，以苏氨酸为底物，加入含有醛缩酶基因和乙酰化乙醛脱氢酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸分解为甘氨酸和乙醛，乙醛直接转化为乙酰辅酶A或乙醛转化为乙酸再转化成乙酰辅酶A；或以苏氨酸为底物，加入含有苏氨酸脱氢酶基因和2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶基因的重组微生物进行发酵，发酵过程中，苏氨酸脱氢得到2
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氨
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3酮丁酸，2
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氨
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3酮丁酸在2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶的作用下得到乙酰辅酶A。9.根据权利要求8所述的利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A的方法，其特征在于，所述醛缩酶基因包括ItaE、TdcB、glyA、Sdsl、bhcC、psald、pdxA或vrtJ中的一种或几种；所述乙酰化乙醛脱氢酶基因包括eutE、bphJ、TTHB247、mhpF、ADH2或hsaG中的一种或几种；所述苏氨酸脱氢酶基因包括tdh、ydfG、pdxA、asd、AKHSDH2或trmG中的一种或几种；所述2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶基因包括kbI、GCAT、Gcat或TTHA1582中的一种或几种。10.根据权利要求8所述的利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A的方法，其特征在于，包括通过基因工程方法构建重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。11.根据权利要求10所述的利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶A的方法，其特征在于，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得所述醛缩酶编码基因、乙酰化乙醛脱氢酶编码基因，或通过PCR扩增获得苏氨酸脱氢酶编码基因、2
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氨
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3酮丁酸CoA连接酶编码基因，将获得的基因连接至质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂梦真，张科春，
申请(专利权)人：元素驱动杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：