基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用。本发明专利技术通过结合RecJ

【技术实现步骤摘要】
基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用


[0001]本专利技术涉及一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用，属于生物分析检测


技术介绍

[0002]电化学生物传感器已在环境监测、食品安全和临床诊断中得到广泛发展。在大多数情况下，电化学生物传感器基于异质机制，因此需要将不同的识别元件固定在电极表面，如适配体、抗体、肽链等。然而，这些异质电化学传感器通常具有一些不可避免的内在缺陷。首先，由于固定化构型的空间位阻增加和自由度降低，电极界面上的固定化可能抑制识别元件与其目标之间的识别效率。其次，在非均质分析过程中，在收集电化学信号之前将识别元件固定在电极表面的过程通常是费力和耗时的。第三，非均质电极表面上识别元件负载密度的批次间差异可能对生物传感重复性和再现性产生不利影响。最后，由于生物材料的自然降解，识别元件固定的电极基板不易于长时间保存。异质电化学生物传感器的上述缺陷极大地阻碍了其在便携式护理点测试(POCT)中的商业应用。因此，希望开发一种无需预固定、灵敏度高的均质电化学传感器，以提升其在商业应用中的可行性。
[0003]由于核酸链的高度可编程性和易于修改，适配体作为有效的识别元件已经开发出具有多种信号放大技术的电化学生物传感器。核酸等温扩增技术包括链置换扩增、滚圈扩增(RCA)、混合链式反应、熵驱动和催化发夹组件等，可以用来高效率和低成本地实现信号放大。其中，RCA可以通过聚合酶介导的复制广泛产生含有大量可编程串联重复序列的长DNA分子，实现溶液相中信号的扩增。此外，还可以引入由核酸酶触发的靶循环来构建高度灵敏的电化学适配体传感器，如核酸外切酶I(Exo I)、核酸外切蛋白酶III(Exo III)、Nb.BbvCI、RecJf核酸外切糖酶。RecJf外切酶是一种功能酶，可以催化从单链DNA(ssDNA)沿其5'端至3'端去除单磷酸DNA。因此，它可以用于水解适配体和靶标复合物中的单个适配体链，连续释放靶标以结合更多相应的适配体。
[0004]在均质电化学适配体传感器系统的构建过程中，电活性信号的引入也受到了关注。作为电化学信号读出元件，氧化还原活性物质如亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc)通常共价标记在DNA末端。然而，引入信号标签带来了更高的成本、更复杂的制备和更低的检测稳定性。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术通过结合RCA技术和RecJ
f
外切酶辅助的靶循环，提出了一种均质电化学适配体传感器，用于癌胚抗原(CEA)检测。当CEA样品加入到溶液A中时，由于靶标和适配体之间的识别，cDNA探针从磁性生物偶联物中释放。同时，RecJ
f
外切酶激活靶循环过程，将CEA释放到新一轮的结合和酶反应中。在反应和磁分离之后，将上清液加入溶液B中以引发RCA反应。随后，在添加氯化血红素(hemin)后，将G
‑
四链体/氯化血红素
(G
‑
quadruplex/hemin)复合物作为电化学信号探针在金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)的表面上孵育。通过使用DPV测量，G
‑
quadruplex/hemin复合物中铁卟啉的Fe
2+
和Fe
3+
之间的电子转移产生了极强的电化学信号。因此，峰值电流值与G
‑
quadruplex/hemin复合物的数量呈正相关，这取决于CEA的浓度。然而，当没有靶时，cDNA不能从磁珠表面中逃逸。即使添加了溶液B，也无法形成RCA产物，从而导致低的背景信号。在该系统中，通过混合溶液来触发目标识别和信号放大过程，这有利于非专业操作和长时间保存。RecJ
f
外切酶辅助靶循环和RCA信号放大的双重扩增机制克服了非均质反应所造成的缺陷，实现了高灵敏的CEA检测。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G
‑
四链体形成溶液和检测电极；
[0007]其中，溶液A中包括由cDNA、适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJ
f
外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA(滚环扩增)反应液。
[0008]进一步地，所述cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物在靶标与适配体结合时，cDNA释放，并由RecJ
f
外切酶辅助完成靶循环扩增。
[0009]进一步地，所述适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。
[0010]进一步地，RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶。
[0011]进一步地，所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
[0012]将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA。
[0013]进一步地，连接探针为5'
‑
AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT
‑
3'(SEQ ID NO.1)；挂锁探针5'p
‑
TTA TTC AAT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTA ACT GTG CGT AGC
‑
3'(SEQ ID NO.2)。
[0014]进一步地，所述检测电极包括工作电极、对电极和参比电极。
[0015]进一步地，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
[0016]进一步地，金电极为金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)。
[0017]本专利技术的第二个目的是提供一种用于肿瘤标志物检测的基于双增策略的均质电化学适配体传感器，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G
‑
四链体形成溶液和检测电极；
[0018]其中，溶液A中包括由cDNA、肿瘤标志物的适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJ
f
外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液。
[0019]进一步地，所述肿瘤标志物为癌胚抗原CEA。
[0020]进一步地，肿瘤标志物为癌胚抗原CEA时，CEA的适配体的序列为：5'
‑
ATACCAGCT TAT TCA ATT
‑
3'(SEQ ID NO.3)。
[0021]进一步地，CEA的适配体的序列修饰生物素之后为：5'
‑
ATA CCA GCT TAT TCA ATT
‑
Biotin
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器，其特征在于，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G
‑
四链体形成溶液和检测电极；其中，溶液A中包括由cDNA、适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJ
f
外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液。2.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物在靶标与适配体结合时，cDNA释放，并由RecJ
f
外切酶辅助完成靶循环扩增。3.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。4.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶。5.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA。6.根据权利要求5所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，连接探针为5'
‑
AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT
‑
3'；挂锁探针5'p
‑
TTA TTC AAT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTA ACT GTG CGT AGC
‑
3'。7.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雨婷，周楠迪，李惠，王晓丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：