检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法。该引物库中的引物的Tm值保持为60

【技术实现步骤摘要】
检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，结核病随着近代人类进化而传播，随着人口密度的增加，于新时期时代在全球范围内迅速扩张。1993年WHO宣布“结核病为全球公共卫生紧急事件”，结束了全球对结核病长期的忽视。2021年10月14日，世界卫生组织发布了涵盖197个国家和地区数据的《2021年全球结核病报告》，报告显示：我国2020年估算的结核病新发患者数为84.2万，估算结核病发病率为59/10万，在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第2位，仅次于印度，结核病已成为危害我国公共卫生安全的重要疾病之一。
[0003]分枝杆菌隶属于放线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属，是一类需氧、无芽孢(除海分枝杆菌外)、无动力、略微弯曲或直杆菌，有时有分枝的微生物。分枝杆菌种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群(MTB)、非结核分枝杆菌(NTM)和麻风分枝杆菌三类。结核分枝杆菌感染人体主要引起肺结核，此外，还可引起淋巴结结核、胸膜结核、泌尿生殖系统结核、骨关节结核、结核性脑膜炎等，几乎所有系统器官均可累积。
[0004]目前结核分枝杆菌的实验室检测方法主要包括以下几种，虽各有优势，但局限性也十分明显：
[0005]传统的分离培养作为结核病诊断的金标准，可以同时实现菌种鉴定和药敏分析，但培养周期长，操作繁琐，往往需要数周时间才能得到结果，有些NTM菌种的培养需要特殊的培养基，或是特定的培养温度，或是需要延长培养时间。
[0006]涂片镜检操作简单、成本低廉，但是灵敏度低，且无法实现菌种鉴别，包括不能识别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
[0007]免疫学方法——抗原检测如公开号为CN107058522A的中国专利技术专利，利用不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，一次性区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。但该检测方法特异性不佳，且无法分型到种，也无法实现药敏测试。
[0008]常用的分子诊断qPCR法和基因组测序法，都可以准确鉴定到种水平，但是前者分型具有一定的局限性，只能检测几种分枝杆菌，耐药基因也往往只能检测少量的一两种。后者是菌种鉴定分辨率最高的手段，但是无法区分一些种间序列高度同源的菌种，如鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌与龟分枝杆菌，且由于MTB核酸提取过程中破壁困难，二代测序对MTB的检测效能相较于其他普通病原体会降低。
[0009]MTB及NTM感染率逐年上升，耐药率高发，但目前的检测方法尚不能在时效性、灵敏度、特异度等方面满足临床需求。

技术实现思路

[0010]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库、试剂盒及检测方法，该方法覆盖广、时效性快、灵敏度高、特异度强，该方法以非诊断为目的。
[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库，引物库中的引物的Tm值保持为60
±
5℃，扩增子长度为100～200bp，引物长度为15～25，GC含量为40～65％，所述引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰。
[0012]本专利技术的另一技术方案为：检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的试剂盒，包括第一轮扩增体系、第二轮扩增体系、阳性质控品、阴性质控品和磁珠。
[0013]本专利技术的又一技术方案为：检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的检测方法，包括以下步骤：
[0014]S1：提取模板DNA；
[0015]S2：使用上述的试剂盒依次进行多重靶向PCR扩增，片段分选、加接头扩增和再次纯化得到文库；
[0016]S3：文库质检后上机进行测序与数据分析，输出数据质控结果和病原检出结果。
[0017]本专利技术的有益效果在于：本专利技术开发了一种利用t
‑
NGS(Targeted enrichment of pathogens for sequencing)多重靶向测序实现分枝杆菌分型鉴定和/或耐药基因检测的引物库、试剂盒及检测方法，是基于多重PCR和二代测序技术原理开发的病原微生物检测项目，通过对分枝杆菌进行分型引物设计，对样本进行靶向扩增，检测并分析样本中的核酸信息，鉴别分枝杆菌的种类，鉴定耐药靶点，辅助临床医生明确诊断分枝杆菌感染，制定精准诊疗方案。
[0018]本专利技术涉及的多重PCR方法操作简单，时间短，灵敏度高，对仪器设备的要求也简单，非常适合临床病原检测的需求。然而多重PCR产品开发的难点在于(1)如何针对广泛的病原体设计特异性的扩增引物，既能够区分不同属或种的病原，又能尽可能的覆盖种间型别差异；(2)如何尽可能降低同一PCR反应管中的几百、几千或几万条引物之间形成二聚体、发卡结构等异常结构；(3)如何调整引物间的扩增效率差异，使各引物间的扩增效率尽量均一；(4)如何灵活的根据需要去调整panel中引物组合，已适应产品性能的优化。
[0019]针对上述难点，本专利技术对引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰，避免引物之间形成二聚体；引物的Tm值保持均一(60℃
±
5℃)，扩增子长度在,100～200bp，引物长度在15～25之间，GC含量在40～65之间，尽量避免上下游引物间形成二聚体、发卡结构等；再通过优化引物投入量、引物投入比例提高引物间扩增效率均一性，优化文库构件体系，实现分枝杆菌分型鉴定和/或耐药基因检测。
附图说明
[0020]图1所示为本专利技术的具体实施方式的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的检测方法的流程图；
[0021]图2所示为本专利技术的具体实施方式的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的文库片段质检结果图。
具体实施方式
[0022]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0023]本专利技术最关键的构思在于：对引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰，避免引物之间形成二聚体。
[0024]本专利技术的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库，引物库中的引物的Tm值保持为60
±
5℃，扩增子长度为100～200bp，引物长度为15～25，GC含量为40～65％，引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰。优选地，引物库中的引物的Tm值保持为60
±
2℃。
[0025]从上述描述可知，对引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰，经RNA碱基修饰的引物只有与模板完全匹配的情况下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库，其特征在于，引物库中的引物的Tm值保持为60
±
5℃，扩增子长度为100～200bp，引物长度为15～25，GC含量为40～65％，所述引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰。2.根据权利要求1所述的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的引物库，其特征在于，所述引物库的二聚体含量＜10％。3.检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的试剂盒，其特征在于，包括第一轮扩增体系、第二轮扩增体系、阳性质控品、阴性质控品和磁珠。4.根据权利要求3所述的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述第一轮扩增体系包括多重PCR扩增预混液、RNaseH2、内参、DNA模板、H2O和权利要求1或2所述的引物库。5.根据权利要求4所述的检测分枝杆菌和/或结核耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR扩增预混液、RNaseH2、内参、DNA模板和H2O的体积比为25:1:10:1:10:3。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，陈浩，郭文浒，张盼，杨洁，薛怡婷，
申请(专利权)人：福州奥吉芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：