一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料的保存液及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料的保存液及使用方法，属于活体部分的保存技术领域。本发明专利技术抑制了组织病料在送检过程抑制霉菌、酵母菌和好氧性腐败菌、革兰氏阳性菌造成的组织腐败，同时不影响革兰氏阴性菌的生长。为副猪嗜血杆菌提供了兼性厌氧环境，并提供了其存活所需要的V因子，提高了病料组织中的副猪嗜血杆菌的存活率，进而增加分离率。本发明专利技术配制简单，易于操作，可以提高病料中副猪嗜血杆菌的存活时间，并提高送检病料副猪嗜血杆菌的分离率，可以用于较长时间保存送检的病料，不易腐败。不易腐败。

【技术实现步骤摘要】
一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料的保存液及使用方法


[0001]本专利技术涉及活体部分的保存
，尤其涉及一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料的保存液及使用方法。

技术介绍

[0002]副猪嗜血杆菌属于革兰氏阴性菌，为兼性厌氧菌；在病料中的分离率比较低，一般患病猪死亡12小时后，在病料中几乎分离不到，因此需在患猪剖杀或死亡12小时内及时进行病原分离。而且副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻，其在巧克力培养基上培养48h生长也较差。一般该菌的分离应采用含NAD、酵母浸出液和10％马血清的TSA培养基。
[0003]中国专利CN112831428A提供了一种副猪嗜血杆菌培养基，所述副猪嗜血杆菌培养基由基础培养液和辅助材料组成；辅助材料为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、酚红指示剂、林肯霉素和马血清的混合物；每L基础培养液的组成：胰蛋白胨15.0～17.0g；植物蛋白胨3.0～5.0g；氯化钠4.0～5.5g；磷酸氢二钾2.0～3.5g；葡萄糖2.0～3.5g；余量水。本专利技术副猪嗜血杆菌培养基中培养基成分营养丰富，非常适宜副猪嗜血杆菌的快速生长，可提高污染病料中该菌的分离率，同时在培养基中添加酚红作为指示剂，一方面不会影响副猪嗜血杆菌生长，另一方面可以指示酸碱性的改变，副猪嗜血杆菌在生长的过程中发酵葡萄糖产酸，可中和培养液中的碱，使酚红的颜色由红色变为黄色，根据酚红颜色变化可判定细菌生长情况。
[0004]中国专利CN114149951A则公开了一种副猪嗜血杆菌培养基及其制备方法。所述副猪嗜血杆菌培养基包括以下组分：基础培养基、辅酶Ⅰ、马血清以及脱纤绵羊血。该专利技术通过在基础培养基中添加辅酶Ⅰ、脱纤绵羊血和马血清，解决了副猪嗜血杆菌在血琼脂培养基上生长必须接种金黄色葡萄球菌的问题，使菌落更纯粹，有效地减少了细菌纯化中杂菌污染的机率；而且，该专利技术培养基营养更充足，更适合副猪嗜血杆菌的生长特性，比巧克力培养基上生长更稳定、菌落更大、保存时间更长。该专利技术提出的副猪嗜血杆菌培养基可以用于培养、鉴别和分离副猪嗜血杆菌，并有效地提高了对该菌的分离成功率。
[0005]目前对于猪场用于分离鉴定副猪嗜血杆菌病料的送检主要是采集新鲜病料，然后置于泡沫箱中，用冰袋冷藏送检，这个过程经常由于冷藏，还有路途长时间的运输，对于病料组织中的副猪嗜血杆菌造成影响，导致实验室在分离过程中无法正常分离到副猪嗜血杆菌，影响送检意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的问题是提供一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料的保存液及使用方法。
[0007]本专利技术提供了一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液的配制方法，包括如下步骤：
[0008]取1.0～1.4mg乳酸链球菌素、40～50mg防腐剂、15～25mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、10～20mg海藻糖与950mL的纯净水混合均匀，随后用氢氧化钠水溶液调节pH值至7.0～7.2，然后用纯净水定容至1L，得到定容液；所述定容液经110～130℃处理10～30min后冷却，得到标准液；使用时，按比例向标准液中添加甘油，得到用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液。
[0009]优选的，所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠、对羟基苯甲酸丙酯中的任意一种。
[0010]优选的，所述标准液与甘油的体积比为(7.5～12.5)：1。
[0011]优选的，所述海藻糖为D
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海藻糖、D
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海藻糖衍生物中的任意一种或两者的混合物。
[0012]进一步的，所述海藻糖为D
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海藻糖、D
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海藻糖衍生物以质量比1：(3.5～5)形成的混合物。
[0013]冷藏有助于维持副猪嗜血杆菌的生物活性，使其得到顺利分离与检测。但水在4℃会发生反常膨胀，并部分形成冰晶，当温度进一步降低时，冰晶所占比例增加，到达或低于0℃时，则将全部转变为冰晶。冷藏过程中冰晶的形成不利于保持副猪嗜血杆菌的存活及功能维持，在冻融过程中，冰晶的生长和再结晶会对副猪嗜血杆菌造成机械损伤和渗透应力，从而破坏其结构。因此，本专利技术采用了D
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海藻糖来降低冷藏过程中可能会出现的不利影响。
[0014]D
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海藻糖在生物保存中作用可以分为两方面。一方面，在保存液中，D
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海藻糖分子可与生物分子以氢键连接，代替空间结构中的水分子，形成保护膜来防治冰晶的产生；另一方面，D
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海藻糖可以形成类似碳水化合物的玻璃体来包覆或与相邻的生物分子结合，使扩散系数降低，并抑制冰晶对生物分子的破坏，维持生物分子的空间结构。然而属于革兰氏阴性菌，其细胞壁有一层外膜，肽聚糖含量较低，脂类物质含量较高。普通的D
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海藻糖具有大量亲水性基团，基于副猪嗜血杆菌的上述特性，D
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海藻糖与副猪嗜血杆菌的相容性较差，在保存液中多呈游离态，作用于副猪嗜血杆菌的比例有限。
[0015]为此，本专利技术提供了一种D
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海藻糖衍生物，用于取代或部分取代保存液中的D
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海藻糖。所述D
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海藻糖衍生物以D
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海藻糖为原料，与经氧化处理的3
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己基十一醇发生加成反应而结合，随后依次与二苯氯甲烷发生取代反应、与乙酸酐进行加成，最后在催化下发生消除反应得到。3
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己基十一醇引入了灵活的亲脂链段，同时D
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海藻糖中的羟基被部分取代为端链酰基，端链酰基因范德华力相互作用的倾向小，使D
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海藻糖衍生物与副猪嗜血杆菌的膜层相互作用时流动性好，利于二者的结合及包覆。
[0016]优选的，所述D
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海藻糖衍生物的制备方法如下：
[0017]M1、将3
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己基十一醇、二乙酸碘苯、2,2,6,6
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四甲基哌啶氧化物与二氯甲烷混合均匀，随后进行氧化反应；氧化反应结束后，将粗产物倒入饱和次亚硫酸钠水溶液中，并用二氯甲烷萃取，回收有机相；有机相经饱和碳酸氢钠水溶液洗涤、饱和食盐水洗涤、干燥、减压蒸馏去除二氯甲烷，得到氧化反应产物，备用；
[0018]M2、另取所述氧化反应产物、D
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海藻糖、对甲基苯磺酸、原甲酸三乙酯与N,N
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二甲基乙酰胺混合均匀，随后在减压环境下进行第一加成反应；第一加成反应完成后，加入三乙胺以停止反应，将粗产物与氯仿混合均匀后过滤并收集滤液，滤液经减压蒸馏去除N,N
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二甲基乙酰胺及氯仿，得到第一加成反应产物，备用；
[0019]M3、另取所述第一加成反应产物、二苯氯甲烷与50～75份甲苯混合均匀，随后在无
氧条件下进行取代反应；取代反应结束后，经减压蒸馏去除甲苯、无水乙醇洗涤、干燥，得到取代反应产物，备用；
[0020]M4、另取所述取代反应产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液的配制方法，其特征在于，包括如下步骤：取1.0～1.4mg乳酸链球菌素、40～50mg防腐剂、15～25mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、10～20mg海藻糖与950mL的纯净水混合均匀，随后用氢氧化钠水溶液调节pH值至7.0～7.2，然后用纯净水定容至1L，得到定容液；所述定容液经110～130℃处理10～30min后冷却，得到标准液；使用时，按比例向标准液中添加甘油，得到用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液。2.根据权利要求1所述的用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液的配制方法，其特征在于：所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠、对羟基苯甲酸丙酯中的任意一种；所述标准液与甘油的体积比为(7.5～12.5)：1。3.根据权利要求1所述的用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液的配制方法，其特征在于：所述海藻糖为D
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海藻糖、D
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海藻糖衍生物中的任意一种或两者的混合物。4.根据权利要求3所述的用于猪场送检副猪嗜血杆菌组织病料保存液的配制方法，其特征在于，所述D
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海藻糖衍生物的制备方法如下，以重量份计：M1、将4.05～5.30份3
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己基十一醇、8.35～10.90份二乙酸碘苯、0.03～0.05份2,2,6,6
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四甲基哌啶氧化物与35～45份二氯甲烷混合均匀，随后进行氧化反应；氧化反应结束后，将粗产物倒入125～175份饱和次亚硫酸钠水溶液中，并用二氯甲烷萃取，回收有机相；有机相经饱和碳酸氢钠水溶液洗涤、饱和食盐水洗涤、干燥、减压蒸馏去除二氯甲烷，得到氧化反应产物，备用；M2、另取1.40～1.85份所述氧化反应产物、4.35～5.65份D
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海藻糖、0.40～0.50份对甲基苯磺酸、1.35～1.80份原甲酸三乙酯与90～120份N,N
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二甲基乙酰胺混合均匀，随后在减压环境下进行第一加成反应；第一加成反应完成后，加入0.45～0.60份三乙胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓红玉，覃智斌，张志榕，邓政，丁能水，龙毅，胡贤和，吴有林，
申请(专利权)人：福建傲芯种业科技集团有限公司泰和县傲牧育种有限公司湖北傲新银河生态农业有限公司，
类型：发明
国别省市：