双CAR-T细胞制造技术

本发明专利技术涉及表达针对两个不同靶点的两种CAR的新工程化免疫细胞、用于制备所述免疫细胞的多核苷酸、包含所述免疫细胞的药物组合物、以及所述免疫细胞在治疗癌症中的用途。以及所述免疫细胞在治疗癌症中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双CAR
‑
T细胞


[0001]本专利技术涉及细胞免疫疗法领域，并且更具体地涉及表达针对两个不同靶点(target，靶标)的两种CAR的用于癌症治疗的新工程化免疫细胞。

技术介绍

[0002]在美国(US)，大约每3分钟就有一个人被诊断出患有血液癌症。在2020年，预估在US将总计有178,520人被诊断出患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。预计白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的新病例将占在2020年的US的诊断的预估1,806,590例新癌症病例的9.9％(Cancer Facts&Figures,2020.美国癌症协会(American Cancer Society))。
[0003]用于血液恶性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的发展代表了过去十年中最显著的治疗进展之一(Holstein et al,2020,Clin.Pharmacol.Ther.107(1):112
‑
122)。的确，作为肿瘤学中快速发展的领域，CAR
‑
T细胞的过继转移在血液恶性肿瘤的治疗中显示出惊人的功效，并已在多项临床试验中得到报道。
[0004]表达嵌合抗原受体(“CAR”)的免疫细胞是被基因工程化以表达通常被设计用于识别特定肿瘤抗原并杀死表达这些肿瘤抗原的癌细胞的CAR的细胞。不排除CAR免疫细胞可以激活免疫系统以消除肿瘤。这些通常是表达CAR的T细胞(“CAR
‑
T细胞”)或表达CAR的自然杀伤细胞(“CAR
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NK细胞”)或表达CAR的巨噬细胞。
[0005]CAR是由与单个融合分子中的一个或多个信号域相关的靶向部分组成的合成受体。通常，CAR的结合部分由源自单克隆抗体的抗原结合结构域组成，所述抗原结合结构域由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段(scFv)包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链和重链可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已经成功使用。第一代CAR的信号域源自CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。第一代CAR已经显示出成功地重定向T细胞的细胞毒性，然而，它们未能在体内提供延长的扩增和抗肿瘤活性。来自共刺激分子的包括CD28、OX
‑
40(CD134)、ICOS和4
‑
1BB(CD137)的信号域已经单独添加(第二代)或组合添加(第三代)以增强生存并且增加CAR修饰T细胞的增殖。CAR已经成功地允许T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原进行重定向(Jena,Dotti et al.2010,Blood 116(7):1035
‑
44)。
[0006]过继免疫疗法，其涉及转移离体产生的自体或同种异体的抗原特异性T细胞，是治疗病毒感染和癌症的一种有前途的策略，如通过美国食品和药物管理局(FDA)批准的CAR
‑
T细胞数量的增加所证实的(例如，Novartis的抗
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CD19 CAR
‑
T替沙来塞(tisagenlecleucel)(Kymriah
TM
)用于治疗前体B细胞急性淋巴细胞白血病、Kite Pharma的抗
‑
CD19 CAR
‑
T阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)(Yescarta
TM
)用于治疗成年患者中某些类型的大B细胞淋巴瘤)。
[0007]尽管CAR
‑
T细胞疗法的研究和开发取得了进展，但仍然需要改进的CAR
‑
T细胞，所述改进的CAR
‑
T细胞可以靶向更宽范围的癌症以及复发性癌症和/或其中癌症相关抗原表达变化很大并且会随着时间或治疗期间或治疗后发展的癌症。

技术实现思路

[0008]本专利技术人已经开发了靶向CD20和CD22抗原的新CAR
‑
T细胞，其可以通过表达不同水平的CD20和CD22的肿瘤细胞激活，并且对现有技术的CAR
‑
T细胞进行改进。
[0009]第一方面涉及在其细胞表面表达对于CD22特异性的嵌合抗原受体(CAR)(CAR22)和对于CD20特异性的嵌合抗原受体(CAR20)的基因工程化免疫细胞，
[0010]a)其中所述CAR22包含：
[0011]i)至少一个胞外结构域，包含：
[0012]‑
对于CD22特异性的抗原结合结构域，包含SEQ ID NO:11的可变重链(VH)和SEQ ID NO:12的可变轻链(VL)，任选地前导序列，
[0013]‑
来自CD8α的铰链结构域(hinge domain，铰链域)，
[0014]ii)来自CD8α的跨膜结构域(transmembrane domain，跨膜域)，和
[0015]iii包含4
‑
1BB刺激结构域(stimulatory domain，刺激域)和CD3ζ信号结构域(signalling domain，信号域，信号转导结构域)的胞内结构域；并且
[0016]b)其中所述CAR20包含：
[0017]i)至少一个胞外结构域，包含：
[0018]‑
对于CD20特异性的抗原结合结构域，包含SEQ ID NO:15的可变重链(VH)和SEQ ID NO:16的可变轻链(VL)，任选地前导序列，
[0019]‑
来自CD8α的铰链结构域，
[0020]ii)来自CD8α的跨膜结构域，和
[0021]iii)包含4
‑
1BB刺激结构域和CD3ζ信号结构域的胞内结构域。
[0022]在特定方面，所述基因工程化免疫细胞是TCR阴性T细胞(TCR negative T
‑
cell)。
[0023]另一方面涉及药物组合物，其包含所述工程化免疫细胞或含有所述工程化免疫细胞的细胞群、以及药学上可接受的赋形剂。
[0024]另一方面涉及分离的多核苷酸，包含：
[0025]a)编码CAR22的核酸，所述CAR22包含：
[0026]i)至少一个胞外结构域，包含：
[0027]‑
对于CD22特异性的抗原结合结构域，包含SEQ ID NO:11的可变重链(VH)和SEQ ID NO:12的可变轻链(VL)，任选地前导序列，
[0028]‑
来自CD8α的铰链结构域，
[0029]ii)来自CD8α的跨膜结构域，和
[0030]iii)包含4
‑
1BB刺激结构域和CD3ζ信号结构域的胞内结构域；以及
[0031]b)编码CAR20的核酸，所述CAR20包含：
[0032]i)至少一个胞外结构域，包含：
[0033]‑
对于CD20特异性的抗原结合结构域，包含SEQ ID NO:15本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基因工程化免疫细胞，所述免疫细胞在它的细胞表面表达对于CD22特异性的嵌合抗原受体(CAR)(CAR22)和对于CD20特异性的嵌合抗原受体(CAR20)，a)其中，所述CAR22包含：i)至少一个胞外结构域，包含：
‑
对于CD22特异性的抗原结合结构域，所述对于CD22特异性的抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的H
‑
CDR，所述可变轻链(VL)包含与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的L
‑
CDR，任选地前导序列，
‑
来自CD8α的铰链结构域，ii)来自CD8α的跨膜结构域，和iii包含4
‑
1BB刺激结构域和CD3ζ信号结构域的胞内结构域；并且b)其中，所述CAR20包含：i)至少一个胞外结构域，包含：
‑
对于CD20特异性的抗原结合结构域，所述对于CD20特异性的抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含与SEQ ID NO:15具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的H
‑
CDR，所述可变轻链(VL)包含与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的L
‑
CDR，任选地前导序列，
‑
来自CD8α的铰链结构域，ii)来自CD8α的跨膜结构域，和iii)包含4
‑
1BB刺激结构域和CD3ζ信号结构域的胞内结构域。2.根据权利要求1所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述CAR22包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且其中，所述CAR20包含SEQID NO:18的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述CAR20和所述CAR22的胞外结构域均不包含安全开关，所述安全开关包含利妥昔单抗特异性模拟表位，如SEQ ID NO:22。4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述CAR由并入所述免疫细胞的基因组中的外源核酸编码，并且其中，所述外源核酸从5
’
到3
’
包含：(i)启动子(如EF1α启动子)，(ii)编码所述CAR20的核酸，(iii)编码自切割肽(如SEQ ID NO:19的P2A)的核酸，(iv)编码所述CAR22的核酸，从而相同的启动子控制所述CAR20和所述CAR22的表达。5.根据权利要求4所述的基因工程化免疫细胞，其中：
‑
(ii)的所述核酸包含SEQ ID NO:1的信号肽、SEQ ID NO:17的scFv、SEQ ID NO:4的CD8α铰链、SEQ ID NO:6的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:8的4
‑
1BB共刺激结构域和SEQ ID NO:9的CD3ζ信号结构域)；并且
‑
(iv)的所述核酸包含SEQ ID NO:1的信号肽、SEQ ID NO:13的scFv、SEQ ID NO:4的
CD8α铰链、SEQ ID NO:6的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:8的4
‑
1BB共刺激结构域和SEQ ID NO:9的CD3ζ信号结构域。6.根据权利要求4和5中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述外源核酸包含SEQ ID NO:32的核酸序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述工程化免疫细胞选自由T细胞、NK细胞和巨噬细胞组成的组。8.根据权利要求1至7中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述工程化免疫细胞是T细胞，例如细胞毒性T细胞。9.根据权利要求1至8中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述工程化免疫细胞包含在细胞群中，所述细胞群如免疫细胞群，特别是T细胞群、NK细胞群和/或巨噬细胞群。10.根据权利要求1至9中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，所述工程化免疫细胞是T细胞，所述T细胞是TCR阴性的。11.根据权利要求10所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述T细胞表达直接针对编码TCR组件的多核苷酸序列的短发夹RNA(shRNA)或小干扰(siRNA)。12.根据权利要求10所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述T细胞在它的TCRα和/或TCRβ等位基因中发生突变。13.根据权利要求10或12中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述T细胞具有编码已经通过突变失活的TCRα、TCRβ和/或CD3的至少一个等位基因。14.根据权利要求8至13中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述T细胞具有选自已经失活的β2m、PD1、CTLA4、dCK、CD52和/或GR的至少一个等位基因。15.根据权利要求9至14中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述T细胞具有已经失活的CD52等位基因。16.根据权利要求1至15中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述细胞、优选T细胞是原代细胞。17.根据权利要求1至16中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述细胞、优选T细胞是哺乳动物细胞、优选人细胞。18.根据权利要求1至17中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中，工程化的所述细胞、优选T细胞不表达除所述CAR22和所述CAR20之外的其他CAR。19.一种免疫细胞群，包含根据权利要求1至18中任一项所述的工程化免疫细胞。20.一种T细胞群，包含根据权利要求9至18中任一项所述的工程化T细胞。21.一种药物组合物，包含根据权利要求1至18中任一项所述的工程化免疫细胞和药学上可接受的赋形剂。22.一种药物组合物，包含根据权利要求19至20中任一项所述的免疫细胞群和药学上可接受的赋形剂。23.一种药物组合物，包含根据权利要求10至18中任一项所述的工程化T细胞和药学上可接受的赋形剂。24.一种药物组合物，包含根据权利要求20所述的T细胞群和药学上可接受的赋形剂。25.一种分离的多核苷酸，包含：
a)编码CAR22的核酸，所述CAR22包含：i)至少一个胞外结构域，包含：
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对于CD22特异性的抗原结合结构域，所述对于CD22特异性的抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的H
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CDR，所述可变轻链(VL)包含与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的氨基酸序列并且包含氨基酸序列SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：