一株产复合酶的耐盐芽孢杆菌及在饲料制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产复合酶的耐盐芽孢杆菌及在饲料制备中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种同时产纤维素酶和木聚糖酶的耐盐芽孢杆菌，可用于生产纤维素酶和木聚糖酶。该菌株生产的纤维素酶和木聚糖酶制剂可以高效降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等木质纤维素，获得葡萄糖等单糖。本发明专利技术的菌株还可用于反刍动物饲料的制备，有助于提高饲料的利用度。用度。用度。

【技术实现步骤摘要】
tyrobutyricum)L319，保藏编号GDMCC No：62289，已公开于公开号为CN115305219A的专利申请文件中。
[0015]在一种实施方式中，所述微生物菌剂中耐盐芽孢杆菌B757的菌浓为8
×
10
10
～8
×
10
12
CFU/g，酪丁酸梭菌的菌浓为8
×
109～8
×
10
11
CFU/g。
[0016]在一种实施方式中，所述微生物制剂在获得单菌粉并经活菌计数后，按照活菌数比例耐盐芽孢杆菌B757：酪丁酸梭菌L319＝10:1复合配制。
[0017]在一种实施方式中，所述微生物菌剂中各微生物的含量如下：耐盐芽孢杆菌B757 8
×
10
11
CFU/g、酪丁酸梭菌8
×
10
10
CFU/g。
[0018]在一种实施方式中，所述微生物菌剂中的辅料包括海藻糖、壳寡糖中的一种或几种，所述辅料主要发挥分散单菌粉、保护微生物细胞的作用。
[0019]在一种实施方式中，所述耐盐芽孢杆菌B757和酪丁酸梭菌L319均分别通过液态发酵、离心、喷雾干燥工艺获得干菌粉，所述干菌粉与辅料混合后得到微生物菌剂。
[0020]本专利技术还提供所述微生物制剂在反刍动物饲料制备中的应用。
[0021]有益效果：
[0022]1、本专利技术筛选获得的耐盐芽孢杆菌B757对外界环境有很强的抵抗力，可完全耐受反刍动物体内胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，相比于酶制剂耐受性强且性质稳定。此外，微生物菌剂货架周期长、易于运输和储存。
[0023]2、本专利技术分离的耐盐芽孢杆菌具有更高的产纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶等复合酶能力和更强的降解纤维素的能力，可提高粗饲料消化率和利用率。
[0024]3、所选用的耐盐芽孢杆菌和酪丁酸梭菌菌株之间的互补性强，通过相互的协同作用降解纤维素；此外，作为新型益生菌，酪丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，丁酸在促进动物生长方面作用显著。因此，耐盐芽孢杆菌和酪丁酸梭菌的复合微生物菌剂在提高粗饲料消化率和利用率的基础上进一步提升动物生产能力中的应用是本专利技术的首创。
[0025]生物材料保藏
[0026]耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B757，分类命名为Bacillus halotolerans，已于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌株保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62887，保藏地址为广州市先烈中路100号大院5号楼5楼。
附图说明
[0027]图1：本专利技术分离筛选的耐盐芽孢杆菌B757菌株在平板上的生长状态。
[0028]图2：本专利技术分离筛选的耐盐芽孢杆菌B757菌株在高渗透压及高胆盐条件下的生长曲线。
具体实施方式
[0029]所述微生物菌剂为专利技术人自主生产；其他辅料皆从饲料市场购买获得。实施例中使用的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)L319，保藏编号GDMCC No：62289，已公开于公开号为CN115305219A的专利申请文件中。
[0030]纤维素酶活性测定方法参考(谈诗谣.瘤胃源11株芽孢杆菌的生理学特性研究及
发酵条件优化[D].大连工业大学,2018.)；木聚糖酶活性测定方法参考(赵龙妹等.产木聚糖酶微生物的筛选鉴定及特性分析[J].家畜生态学报,2022,43(04):14
‑
20.)。
[0031]纤维素酶活定义为：在25℃，pH7.0环境下，每1min水解底物生成1μmoL葡萄糖所需的酶量定义为1U。
[0032]木聚糖酶活性定义为：在25℃，pH7.0条件下，每分钟水解0.01mol木聚糖产生1μmoL还原糖(木糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
[0033]实施例1：耐盐芽孢杆菌B757的分离与鉴定
[0034]样品采集：选择微生物分离最佳采样时间，并结合当地实际气候情况，于春季4月对辐射污染某区域，进行样品的采集。在各采样点除去5cm的表层土后，取5
‑
30cm深的土壤(混匀)装入无菌的取样管里，并放置在铅板盒里，
‑
4℃冰箱保存，备用。
[0035]菌株分离：取上述土样1g，加入99ml无菌生理盐水中，混匀后吸取1ml液体加入以CMC(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的液体培养基中，于30℃、200rpm的条件下培养24h后，吸取1ml液体加入以CMC为唯一碳源的液体培养基中，于30℃、200rpm的条件下继续振荡培养24h，如此反复三次进行富集培养。最后，取培养液梯度稀释后，涂布于以CMC为唯一碳源的平板培养基，并于30℃下培养48h。根据平板培养基上菌落所产生的透明圈大小，筛选出50株能较好利用CMC的菌株，透明圈越大说明菌株产纤维素酶的能力越强。
[0036]接下来，将分离得到的单菌落接种在添加了2％ AZCL
‑
小麦阿拉伯木聚糖的LB培养基上进行筛选，于30℃下培养48h以测试菌落是否有木聚糖酶活性。根据LB平板上产生的蓝色水解圈，对水解圈大的菌株进行编号，转接到斜面，作为目标菌备用。
[0037]对6株筛选获得的芽孢杆菌属的菌株的纤维素酶活性、木聚糖酶活性进行测定。挑取菌株的单菌落，接种至LB培养基中，于30℃培养24h，检测发酵液中的酶活。结果见表1。获得具有最高产纤维素酶和木聚糖酶能力的菌株1株，将其甘油保藏，编号为B757，对其进行16srDNA鉴定，结果为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)。可见，本专利技术所筛选的耐盐芽孢杆菌B757具有较强的产纤维素酶和木聚糖酶的能力，可将其制成菌粉，用于多种饲料产品的研发。
[0038]表1目标菌株的酶活性测定结果
[0039]菌株编号纤维素酶(U/ml)木聚糖酶(U/ml)B757159.4106.4B895130.7107.7B914140.165.7B357104.759.7B15498.498.4B322116.7110.7
[0040]实施例2：耐盐芽孢杆菌B757耐受性能验证
[0041]种子培养基(g/L)：葡萄糖10，K2HPO
4 4.8，KH2PO
4 3.5，(NH4)2SO
4 2，MgCl
2 0.16，CaCl
2 0.02，Na2MoO4·
2H2O 0.0024，FeCl
3 0.0018，MnCl2·
2H2O 0.0015，NaCl 10，初始pH7.0。
[0042](1)在12％NaCl条件下的生长性能
[0043]将耐盐芽孢杆菌B757种子液以2％的接种量转接至12％NaCl的种子培养基中，每
间隔一定时间取样，测定OD
600
处的吸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产纤维素酶和木聚糖酶的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B757，已于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌株保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62887。2.含有权利要求1所述耐盐芽孢杆菌B757的微生物菌剂。3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌B757和酪丁酸梭菌。4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)L319，保藏编号GDMCC No：62289。5.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中耐盐芽孢杆菌B757和酪丁酸梭菌的菌浓之比为(8～10):1。6.根据权利要求2～5任一所述的微生物菌剂，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：江凌，刘振磊，朱政明，杨智晗，朱丽英，刘瑜欣，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：