【技术实现步骤摘要】
呼吸道类器官的体外诱导及其应用
[0001]本专利技术属于细胞分化和再生医学领域,具体地涉及类器官的体外培养。
技术介绍
[0002]在呼吸系统疾病领域,有许多难治性疾病。由于除外科肺移植外没有有效的治疗方法,对于研究用细胞模型、器官模型、细胞治疗等肺部再生医学的需求越来越大。到目前为止,虽然已经建立了从人多能干细胞(PSC)、组织驻留的成体干细胞(ASC)、胚胎肺、胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPSC)生成肺类器官的方案,然而仍然需要改进肺类器官的体外培养系统。尤其是,当前肺祖细胞(NKX2.1)的分化及数量效率很低,极大限制了肺类器官在细胞治疗、药物筛选等领域中的应用。因此,建立快速大量并高表达NKX2.1的肺祖细胞,及基于所述肺祖细胞的分化体系具有非常重要的科学及临床转化意义。
技术实现思路
[0003]本专利技术提供了将胚胎干细胞分化形成前部前肠内胚层,将所收集或分离的前部前肠内胚层小球进行解离并形成肺祖细胞,然后所述肺祖细胞分化形成成熟的气道肺类器官以及肺泡类器官的方法。所述方法能够获得产量更高的特异性高表达NKX2.1的肺祖细胞,并且简单易行。
[0004]第一方面,本专利技术提供了诱导形成肺祖细胞的方法,所述方法包括如下步骤:
[0005](1)获得前部前肠内胚层细胞团,将前部前肠内胚层细胞团解离成前部前肠内胚层细胞;以及
[0006](2)将前部前肠内胚层细胞诱导形成肺祖细胞。
[0007]在一些实施方案中,所述前部前肠内胚层细胞诱导形成肺祖细胞的纯度在 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.诱导形成肺祖细胞的方法,所述方法包括如下步骤:(1)获得前部前肠内胚层细胞团,将前部前肠内胚层细胞团解离成前部前肠内胚层细胞;以及(2)将前部前肠内胚层细胞诱导形成肺祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述前部前肠内胚层细胞诱导形成肺祖细胞的纯度在95%以上,优选在97%以上。3.根据权利要求1所述的方法,其中所述肺祖细胞表达标志物NKX2.1和/或SOX9和/或SOX2。4.根据权利要求1所述的方法,其中前部前肠内胚层细胞团是由干细胞诱导形成定型内胚层细胞,以及将定型内胚层细胞诱导获得,优选地,所述干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞,优选地,所述胚胎干细胞为分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系,优选地,所述干细胞为多能干细胞,优选地,所述干细胞为诱导多能干细胞(iPSC),优选地,所述干细胞为人源或非人源哺乳动物干细胞。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述将干细胞诱导形成定型内胚层细胞包括用添加有Activin A和GSK3β信号通路抑制剂的培养基培养胚胎干细胞,优选地,所述添加有Activin A和GSK3β信号通路抑制剂的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了Activin A和GSK3β信号通路抑制剂的培养基;优选地,所述GSK3β信号通路抑制剂包括但不限于:CHIR99021、BIO、IM
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12、TWS119、1
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Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR
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A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080,更优选地,所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021,更优选地,所述培养基中CHIR99021的浓度为0.1
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3μM;更优选地,所述培养基中Activin A的浓度为80
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120ng/mL;更优选地MCDB131培养基作为将干细胞诱导形成定型内胚层细胞的基础培养基。6.根据权利要求5所述的方法,其中在3天内将干细胞诱导形成定型内胚层细胞,优选地,所述将干细胞诱导形成定型内胚层细胞的步骤包括:第0天(D0)利用添加有Activin A和GSK3β信号通路抑制剂的培养基培养胚胎干细胞;第1天(D1)利用添加有Activin A和GSK3β信号通路抑制剂的培养基继续培养;第2天(D2)利用添加有Activin A的培养基继续培养。7.根据权利要求4所述的方法,其中所述将定型内胚层细胞诱导形成前部前肠内胚层细胞团包括用添加有TGFβ信号通路抑制剂,BMP信号通路抑制剂,FGF4,SHH激动剂和GSK3β信号通路抑制剂的培养基培养胚胎干细胞;优选地,所述添加有TGFβ信号通路抑制剂,BMP信号通路抑制剂,FGF4,SHH激动剂和GSK3β信号通路抑制剂的培养基是在前部前肠内胚层细胞培养基中添加了TGFβ信号通路抑制剂,BMP信号通路抑制剂,FGF4,SHH激动剂和GSK3β信号通路抑制剂的培养基;优选地,所述TGFβ信号通路抑制剂选自LY2109761、A83
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01、SB
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525334、SD
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208、EW
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7197、Disitertide、LY3200882、SM16或SB431542,
更优选地,所述TGFβ信号通路抑制剂为SB431542,更优选地,所述SB431542的浓度为5
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15μM;优选地,所述BMP信号通路抑制剂选自Noggin、Dorsomorphin、DMH1或LDN
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193189,更优选地,所述BMP信号通路抑制剂为Noggin,更优选地,所述Noggin的浓度为150ng/mL
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250ng/mL;优选地,所述FGF4的浓度为400
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600ng/mL;优选地,所述GSK3β信号通路抑制剂选自CHIR99021、BIO、IM
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12、TWS119、1
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Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR
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A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080,更优选地,所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021,更优选地,所述培养基中CHIR99021的浓度为1
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3μM;优选地,所述SHH激动剂选自SHH或SAG,更优选地,所述SHH激动剂为SAG,更优选地,所述培养基中SAG的浓度为0.5
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1.5μM;优选地,以DMEM/F
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12培养基或DMEM/F
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12改良培养基作为定型内胚层细胞诱导形成前部前肠内胚层细胞团的基础培养基。8.根据权利要求7所述的方法,其中在5天内将定型内胚层细胞诱导形成前部前肠内胚层细胞团;优选地,3D前部前肠内胚层小球在AFE阶段第3天出现,游离漂浮的前部前肠内胚层小球将出现在AFE阶段第4
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7天。9.根据权利要求1所述的方法,其中所述前部前肠内胚层细胞团为前部前肠内胚层小球,优选地,将所收集的前部前肠内胚层小球解离成前部前肠内胚层单细胞。10.根据权利要求1所述的方法,其中所述将前部前肠内胚层细胞诱导形成肺祖细胞包括将前部前肠内胚层单细胞在细胞外基质或水凝胶条件下进行培养,优选地,将前部前肠内胚层单细胞在Matrigel中,利用肺祖细胞(LPC)培养基诱导为肺祖细胞;优选地,利用Matrigel基质或蛋白类水凝胶进行细胞培养,并加入生长因子使细胞能够在悬浮且稳定的环境下进行增殖与分化,优选地,所述肺祖细胞培养基包含Notch信号通路抑制剂,BMP4,成纤维细胞生长因子7(FGF7),成纤维细胞生长因子1...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘会生,孙佳琦,孙辉,徐涛,
申请(专利权)人:广州国家实验室,
类型:发明
国别省市:
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