本发明专利技术公开了一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列，涉及银杏酸合成技术领域，合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术采用上述的一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列，对银杏酸的合成调控提供新靶点，为银杏酸及其相关产品的高品质生产提供新思路。并且，该方法在生物体内部进行，不需要加入任何其他成分，使得仅需要正常种植转入目标基因的植株即可高效生成银杏酸。即可高效生成银杏酸。即可高效生成银杏酸。
【技术实现步骤摘要】
一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列
[0001]本专利技术涉及银杏酸合成
，尤其是涉及一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列。
技术介绍
[0002]银杏酸是一种长链烷基酚酸类代谢物，多产生于银杏叶及银杏白果外种皮中，是银杏中除了类黄酮及银杏内酯外另一种含量丰富的成分。高含量银杏酸使银杏相关产品有强毒性，可引起严重的过敏反应、基因突变及神经损伤，因此有效控制银杏酸的合成是提高银杏种质的关键因素之一。另外，银杏酸具有抗菌及强烈的杀虫作用，在体外可以抑制结核杆菌的生长，具有抗肿瘤、抗病毒及抗氧化等多种药理活性，因此高效合成银杏酸具有良好的市场前景。
[0003]目前，银杏酸主要通过化学合成获得。但上述方法对资源的要求量大，对环境污染度高且合成过程较复杂，难度大，操作过程中保护不当易产生血管刺激症状及其他一系列中毒反应。据此，生物合成是可以有效解决上述问题的良好途径。
[0004]在生物合成方面，虽然已经对银杏酸的生物合成过程进行了假设与推理，但尚未找到一种在银杏酸生物合成方面发挥重要作用的关键酶，不能真正实现银杏酸的异源生物合成。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列，全过程在生物体内部进行，不需要加入任何其他成分，仅需正常种植转入目标基因的植株即可高效生成银杏酸。
[0006]为实现上述目的，本专利技术一方面提供了一种生物合成银杏酸的基因，合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术另一方面提供了一种生物合成银杏酸的方法，步骤如下：S1、构建具有所述合成银杏酸基因的重组载体；S2、将携带步骤S1构建的重组载体的发根农杆菌转化到植株中；S3、对步骤S2获得的植株培养，筛选阳性转化植株；S4、对步骤S3获得的阳性植株进行提取获得银杏酸；S5、对步骤S4获得银杏酸进行检测。
[0008]优选地，步骤S1中重组载体为具有XhoI、XbaI酶切位点的过表达载体。
[0009]优选地，步骤S3中，筛选阳性转化植株的特异性引物为（1）
‑
（2）中任意组；（1）引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列组成；（2）引物对为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列组成。
[0010]优选地，步骤S4中，提取银杏酸的方法如下：S41、收集植株样本，使用液氮磨碎，冻干；S42、加入石油醚，超声波辅助萃取后放入离心机中离心，然后取其上清液加入新离心管中，重复三次，合并三次上清液；S43、将上清液置于冻干机中过夜浓缩，即得银杏酸干粉。
[0011]优选地，步骤S5中，检测银杏酸的方法和参数如下：S51、将步骤S43获得的银杏酸干粉复溶后，使用0.22μm针筒式滤膜过滤器对溶液进行过滤，即得银杏酸溶液；S52、将提取液使用高效液相色谱分离，具体参数如下：
①
分离色谱柱为XBridge
®ꢀ
BEH C18（150mm
×
3mm，2.5μm，Waters, USA）；
②
流动相A为水（含0.01%甲酸，v/v），B为甲醇；
③
梯度洗脱程序：0min, 10%A, 90%B (v/v)；8min, 100%B; 11min, 100%B;11.5min, 10%A,90%B，16min停止分析；
④
流速是0.4ml/min；柱温是35℃；进样量2μl。
⑤
紫外检测器（检测波长312nm）；S53、将提取液使用电喷雾电离系统的三重四级杆质谱检测，具体参数如下：
①
氮气温度：350℃；
②
气体流速：10L/min；
③
喷雾气压：45psi；
④
毛细管电压：
‑
4000V；
⑤
多反应监测模式，母离子/子离子对数值如下：373/329（银杏酸17：1）；371/327（银杏酸17：2）；347/303（银杏酸15：0）；345/301（银杏酸15：1）；319/275（银杏酸13：0）；Dwell值为100；Fragmentor值为100；Collision Energy值为25；Cell accelerator Voltage值为4；Polarity值为Negative。
[0012]因此，本专利技术采用上述一种生物合成银杏酸的方法及其基因序列，具有如下技术效果：（1）本专利技术提供了一种绿色高效异源生物合成银杏酸的新方法。
[0013]（2）本专利技术提供了银杏酸主效合成基因Gb_29977、Gb_19155的序列，并验证了其功能，并进一步公开两种基因的生物合成过程。
[0014]（3）本专利技术对银杏酸的合成调控提供新靶点，为银杏酸及其相关产品的高品质生产提供新思路。
[0015]（4）本专利技术在生物体内部进行，不需要加入任何其他成分，使得仅需要正常种植转入目标基因的大豆即可高效生成银杏酸。
[0016]（5）本专利技术降低了在银杏酸合成过程中可能出现的中毒反应，该方法属于植物自然生长过程，合成过程中降低了对自然环境的污染程度。
附图说明
[0017]图1是大豆根毛转基因阳性苗鉴定，其中，（a）为Gb_19155、Gb_29977、Gb_20355基因的凝胶图；（b）为内参actin基因的凝胶图；图2是Gb_19155、Gb_29977、Gb_20355基因转录活性定量分析；图3是三种转基因大豆根毛中5种银杏酸结构式示意图；图4是三种转基因大豆根毛中5种银杏酸定量分析示意图；图5是三种转基因大豆根毛中5种银杏酸LC
‑
MS/MS定性示意图。
具体实施方式
[0018]除非另外定义，本专利技术使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
[0019]一、构建大豆根毛遗传转化体系；A.表达载体的构建：（1）选取四月份生长期银杏叶片进行基因的克隆分离；（2）利用“SPARKeasy Improved Plant RNA Kit”（山东思科捷生物技术有限公司）提取总RNA；（3）利用“Hifair
®ꢀⅢꢀ
1st Strand cDNA Synthesis Kit”（翌圣生物科技（上海）股份有限公司）将其反转录为cDNA；（4）利用PCR方法对三种基因进行扩增，所用试剂为“2
×
Taq Master Mix”（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。
[0020]其中，Gb_29977基因片段的特异性引物为：正向引物：5
‑
ATGGGCAGTAACGGAAACATGCAGA
‑
3（SEQ ID NO.7）；反向本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种生物合成银杏酸的基因序列，其特征在于：合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，合成银杏酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种生物合成银杏酸的方法，其特征在于，步骤如下：S1、构建具有合成银杏酸基因的重组载体；S2、将步骤S1构建的重组载体转化植株；S3、筛选携带目的基因的样本；S4、提取步骤S3阳性样本中的银杏酸；S5、检测所提取的银杏酸。3.根据权利要求2所述的一种生物合成银杏酸的方法，其特征在于：步骤S1中重组载体为具有XhoI、XbaI酶切位点的过表达载体。4.根据权利要求2所述的一种生物合成银杏酸的方法，其特征在于：步骤S3中，筛选阳性转化植株的特异性引物为a
‑
b中任意组；a．引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列组成；b．引物对为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列组成。5.根据权利要求2所述的一种生物合成银杏酸的方法，其特征在于，步骤S4中，提取银杏酸的方法如下：S41、收集植株样本，使用液氮磨碎，冻干；S42、加入石油醚，超声波辅助萃取后放入离心机中离心，然后取其上清液加入新离心管中，重复三次，合并三次上清液；S43、将上清液置于冻干机中过夜浓缩，得银杏酸干粉。6.根据权利要求5所述的一种生物合成银杏酸的方法，其特征在于，步骤S5中，检测银杏酸的方法和参数如下：S51、将步骤S43获得的银杏酸干粉复溶后，使用0.22μm针筒式滤膜过滤器对溶液进行过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟杰，王国霖，唐贤丰，周功克，李帅，贺郭，陆宜斌，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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