本发明专利技术涉及A型肉毒毒素轻链(BoNT/A LC)突变体的优化改造及其应用。本发明专利技术采用定本发明专利技术涉及BoNT/A LC突变体的优化改造及其应用。采用定点突变方法获得4种突变体，与野生型BoNT/A LC相比，49Deletion和52RRR对SNAP25无切割活性，52DDD和52SRN的活性显著降低。52RRR和52SRN显著切割Syntaxin。本发明专利技术提供的BoNT/A LC突变体替换全长BoNT/A的LC，49Deletion可在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物中应用；52RRR和52SRN可在制备对BoNT/A不响应的医美产品及相关药物中应用；52RRR可在制备治疗Syntaxin介导的高分泌疾病和卒中后痉挛、肌张力障碍相关疾病的药物中应用。用。
【技术实现步骤摘要】
A型肉毒素轻链突变体的优化及其应用
[0001]本专利技术属于医药
，公开了A型肉毒毒素轻链第49和50位氨基酸缺失和52位至54位氨基酸被替代的任一形式突变。具体地讲，是BoNT/A LC突变体49Deletion、52DDD、52RRR、52SRN。该轻链突变体在采用基因工程技术手段替换A型肉毒毒素野生型轻链部分后，可在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物，或在制备对A型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物，或在制备Syntaxin介导的高分泌疾病药物以及在制备肌张力障碍相关疾病的药物中应用。
技术介绍
[0002]肉毒毒素(Botulinum neurotoxins，BoNTs)由厌氧芽孢革兰氏阳性细菌肉毒梭菌和相关物种产生，是人类肉毒杆菌中毒的病原体，根据免疫抗原的不同，可分为A
‑
G七种型别。而所有的肉毒素血清型都有相似的整体结构，其成熟加工形式为150kDa的二硫键异二聚体，由50kDa的轻链和100kDa的重链组成。该异源二聚体包括3个主要功能域，重链C端域(HC
C
)，负责毒素与神经元受体特异性结合，形成毒素
‑
受体复合物，通过胞吞作用进入细胞，后囊泡腔酸化，重链N端域(HC
N
)，在囊泡薄膜上形成一个蛋白质传导通道，将轻链转运到细胞质，在靶神经元的胞浆中，轻链(LC)域显示其锌金属蛋白酶活性，特异性水解SNAREs(可溶性N
‑
乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)，而SNARE复合物是神经递质胞吞所必需的，所以肉毒素中毒会导致神经肌肉接点突触前神经递质释放的抑制，进而使得神经肌肉麻痹
[1]。不同的血清型在蛋白水解靶点上存在差异，其中BoNT/B，BoNT/D，BoNT/F，BoNT/G切割VAMP(也称为synaptobrevin)/vesicle
‑
associated membrane protein isoforms 1，2，3；BoNT/A，BoNT/E切割SNAP25(25kDa的突触体相关蛋白)；BoNT/C切割SNAP25和Syntaxin1，2，3
[2]。
[0003]BoNT/A毒性最强，作用时间最久，应用也最广，BoNT/A最初被批准用于眼睑痉挛、面肌痉挛和斜视的治疗，后应用范围逐步扩大，现在包括各种神经肌肉疾病、自主神经和其他非神经元疾病
[3]。随着BoNT/A的临床应用越来越广，一些患者对这种血清型的毒素不响应或者在长期治疗后由于特异性免疫反应而产生耐药性，从而产生BoNT/A无效
[4]。因此，本专利技术拟采用基因工程手段对A型肉毒毒素进行突变改造，使BoNT/A对除SNAP25以外的底物产生切割活性，从而克服上述BoNT/A存在的缺陷。由于这种突变改造仅改造轻链部分即可，在获得适宜轻链突变体后，可以方便地采用基因工程技术手段替换A型肉毒毒素野生型轻链部分获得全长突变体野生型毒素，这是同领域技术人员可以理解的。
[0004]此外，Syntaxin在Ca
2+
触发的神经元突触囊泡和内分泌细胞致密核心囊泡的胞吐中至关重要，Syntaxin 1a的裂解显著减少了胞吐。除了胞吐外，Syntaxin还有许多其他功能，包括调节K
+
通道，Ca
2+
通道和K
‑
ATP通道，其中K
‑
ATP通道在II型糖尿病治疗中非常重要，Syntaxin的裂解会增加K
‑
ATP通道的活性，从而减少β细胞的激活，恢复正常的胰岛素分泌
[5]。BoNT/C具有切割Syntaxin的活性，将其轻链突变后，去除其SNAP25切割活性，可用于涉及Syntaxin介导的高分泌疾病的治疗。最后，研究表明，BoNT/C经过突变仅保留对
SNAP
‑
25proteolysison neuromuscular transmission[J].PLoS Pathogens,2017,13(8):e1006567.
[0015][7]Miyashita S I,Zhang J,Zhang S,et al.Delivery ofsingle
‑
domain antibodies into neurons using a chimeric toxin
‑
basedplatform is therapeutic in mouse models of botulism[J].Science translational medicine,2021,(13)575.
技术实现思路
[0016]本专利技术目的是提供一种A型肉毒毒素突变体及其在制备相关疾病药物中的应用。
[0017]本专利技术公开了A型肉毒毒素轻链(BoNT/ALC)第49和50位氨基酸缺失和52位至54位氨基酸被替代的任一形式的突变体。具体地讲，本专利技术采用定点突变技术，以全合成野生型BoNT/ALC(Seq ID No:10)载体为模板，PCR获得了4种A型肉毒毒素轻链(BoNT/ALC)突变体，挑取克隆，提取质粒，外协委托金唯智公司进行测序，测序结果(Seq ID No:6,Seq ID No:7,Seq ID No:8,Seq ID No:9)与理论突变序列比对，验证一致后，将保存的菌种复苏，采用大提试剂盒提取无内毒素质粒，然后使用脂质体转染法，将质粒转染HEK293T细胞，进行病毒包装，包装72h后，超速离心收集病毒，以病毒感染原代培养的海马神经元细胞，感染48h后，裂解细胞提蛋白，采用Western Blot检测本专利技术所获得的BoNT/ALC突变体切割底物SNAP25、Syntaxin的活性。
[0018]本专利技术涉及BoNT/ALC突变体的优化改造及其应用。本专利技术以含野生型BoNT/ALC的lenti载体为模板，采用定点突变的方式获得4种突变体，并对获得的BoNT/ALC突变体进行细胞水平酶切活性检测分析实验，评价它们对底物SNAP25和Syntaxin的切割活性，结果表明：BoNT/A LC突变体49Deletion和52RRR对BoNT/A的底物SNAP25均无切割活性，BoNT/A LC突变体52DDD和52SRN对SNAP25仍保留切割活性，但显著低于BoNT/ALC野生型。此外，BoNT/ALC突变体52RRR和52SRN对C型肉毒毒素的底物Syntaxin具有显著的切割活性。
[0019]本专利技术提供的BoNT/ALC突变体49Deletion对底物SNAP25和Syntaxin均无切割活性，它可替换全长肉毒毒素的轻链部分，在以将全长肉毒毒素作为载体制备神经系统给药靶向递送药物中应用。本专利技术提供的BoNT/A LC突变体52RRR和52SRN对Syntaxin有切割活性，可在制备对A型肉毒毒素不响应的医美产品及相关药物中应用。本专利技术提供的BoNT/A LC突变体52RRR仅对Syntaxin具有切割活性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种BoNT/A的轻链突变体，其特征在于该突变体为BoNT/A轻链第49和50位氨基酸缺失和52位至54位氨基酸被替代的任一形式突变。2.根据权利要求1所述的一种BoNT/A的轻链突变体，其特征在于该突变体为BoNT/A LC突变体49Deletion，其氨基酸序列为Seq ID No:1所示。3.根据权利要求1所述的一种BoNT/A的轻链突变体，其特征在于该突变体为BoNT/A LC突变体52DDD，其氨基酸序列为Seq ID No:2所示。4.根据权利要求1所述的一种BoNT/A的轻链突变体，其特征在于该突变体为BoNT/A LC突变体52RRR，其氨基酸序列为Seq ID No:3所示。5.根据权利要求1所述的一种BoNT/A的轻链突变体，其特征在于该突变体为BoNT/A LC突变体52...
【专利技术属性】
技术研发人员：王东升，马文娟，支德娟，谭详敏，王予，刘博，马万通，刘子烨，张冰冰，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：
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