【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过自适应扫描定位单个荧光染料分子的方法和荧光显微镜
[0001]专利技术的
[0002]本专利技术涉及根据MINFLUX原理的高分辨率的定位显微镜。特别地,本专利技术涉及在多个扫描位置扫描荧光染料的单个染料分子时单独调整扫描参数以确定染料分子的位置的方法。本专利技术还涉及执行该方法的荧光显微镜。
现有技术
[0003]文献WO 2015/097000 A1描述了一种用于定位空间上孤立的荧光染料分子的方法,该方法现在以首字母缩写MINFLUX而闻名,其中在不同的位置以激发光的具有强度最小值的强度分布扫描每个单独的染料分子。针对每个扫描位置,记录被激发光激发的荧光发射,并且根据荧光的强度沿强度最小值位置的走向推断出各个分子的位置。当然,这种定位是有误差的,但通过迭代地应用该方法可以降低定位的误差。为此,在每个迭代步骤之前都对扫描位置进行调整,即将扫描位置布置得更靠近分子的各自假定的位置。同时,增强激发光的强度,使得强度梯度在强度最小值附近增大。可替代地,可以增加测量持续时间,这相当于在有效光量方面增加激发光的强度。利用调整的参数,在每个经调整的扫描位置依次照射分子,并记录荧光发射的强度。根据荧光信号与强度最小值的位置的相关性,现在可以用比之前更小的误差来确定分子的位置。这些方法步骤可以重复进行,直到定位收敛或者直到达到另一中止标准,例如预先设定的最大可接受误差。根据现有技术,MINFLUX方法可实现的定位精度约为1nm,代表了最精确的商业化荧光分子定位方法。
[0004]文献WO 2015/097000 A1进一 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对样本(27)中的一种或更多种荧光染料(9、11)的单个染料分子(4、5、6)进行空间上高精度定位的方法,其中,所述荧光染料(9、11)能够在第一荧光状态(12)和第二状态之间在至少一个方向上转变,所述第一荧光状态在荧光波长范围内能够被激发变成荧光发射,所述第二状态在所述第一状态激发时在所述第一状态的荧光波长范围内不表现出荧光发射,所述方法包括以下方法步骤:生成处于第一荧光状态(12)的单个染料分子(4、5、6)的分布,其中在用激发光(25)激发时发射相同荧光波长范围内的荧光的相邻荧光染料分子(4、5、6)的间距高于光学衍射极限值;从所述分布中选择荧光染料分子(4、5、6),其中所选择的染料分子(4、5、6)的位置是近似已知的,优选地其位置不确定性小于250nm;用所述激发光(25)激发所选择的染料分子(4、5、6);按照扫描规则在距所述染料分子(4、5、6)的位置不超过250nm的距离布置的多个扫描位置(16、21)用扫描光(26)的具有局部最小值的强度分布来扫描所述染料分子(4、5、6),其中所述扫描光能够是所述激发光(25)或荧光阻抑光;在每个扫描位置(21)探测荧光(34)的光子数量或强度;根据所述荧光(34)的光子数量或强度以及所述扫描位置(16、21)来确定所述染料分子(4、5、6)的位置,其中位置不确定性至少减少了10倍,其特征在于,在扫描所述染料分子(4、5、6)之前,借助于扫描式激光显微镜记录所述样本(27)的网格图像(1)或所述样本(27)的包括所述染料分子(4、5、6)的片段,并且根据所述染料分子(4、5、6)的位置处的所述网格图像(1)的一个像点的信号或根据所述染料分子(4、5、6)周围环境的所述网格图像(1)的多个像点的信号来确定用于扫描所述染料分子(4、5、6)的扫描规则。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述扫描规则(17、20)设定了以下参数中的一个或更多个:所述样本中所述扫描位置(16、21)的数量和部位,与所述扫描位置(16、21)相关联的扫描持续时间,与所述扫描位置(16、21)相关联的所述荧光(34)的最小光子数量或最小强度,在所述扫描位置(16、21)之间插入的等待时间,与所述扫描位置(16、21)相关联的所述激发光和/或所述扫描光的强度,所述激发光和/或所述扫描光的波长。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,确定所述扫描规则(17、20)包括从预先设定的扫描规则(17、20)集合中选择一扫描规则(17、20)。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述集合中的扫描规则(17、20)适应于不同荧光染料(9、11)的特性。5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于,选择所述扫描规则(17、20)是通过针对该任务训练的人工神经网络来执行的,所述人工神经网络使用所述网格图像(1)或从所述网格图像(1)计算的输入向量作为输入。6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,确定所述扫描规则(17、20)包括计算函
数或执行算法,其中将所述网格图像(1)的一个或更多个像点的所述信号作为自变量传递给所述函数或所述算法。7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法,其特征在于,在部分扫描位置(16、21)处扫描所述染料分子(4、5、6)之后更新或重新确定所述扫描规则(17、20),并且按照更新或重新确定的扫描规则(17、20)继续扫描。8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,考虑到在已经扫描的扫描位置(16、21)探测到的所述荧光(34)的所述光子数量或强度,更新或重新确定所述扫描规则(17、20)。9.根据权利要求1至8中的一项所述的方法,其特征在于,对于所述染料分子(4、5、6)的扫描和对于所述网格图像(1)的扫描式采集,使用共同的扫描装置、相同的激发光(25)、共同的光路和/或共同的子光路。10.根据权利要求1至9中的一项所述的方法,其特征在于,所述网格图像(1)是共焦探测的网格图像(1)或用多光子激发、特别是双光子激发记录的具有荧光强度信号或荧光寿命信号的网格图像(1)。11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述第二状态也是荧光状态,所述荧光状态能够以与所述激发光(25)的波长不同的波长选择性地激发,和/或所述第二状态的荧光发射发生在与所述荧光波长范围不同的波长范围...
【专利技术属性】
技术研发人员:B,
申请(专利权)人:阿贝锐纳仪器有限公司,
类型:发明
国别省市:
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