一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤靶向的亲和多肽及其应用。亲和多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.5之一，亲和多肽能够高效亲和小窝膜联蛋白Annexin A1，并衍射出生物活性片段、亲和噬菌体、进行相关编码的核苷酸序列、复合纳米材料或者噬菌体复合材料。本发明专利技术的靶向多肽，包含以上多肽的生物活性片段，展示以上多肽的噬菌体以及偶联有以上多肽的其他生物纳米材料，均可以与抗癌药物结合形成复合纳米材料，有效靶向并治疗高表达AnnA1的肿瘤，结合力强，特异性高。特异性高。特异性高。

【技术实现步骤摘要】
一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽及应用


[0001]本专利技术属于生物医学领域的一种抗癌制药的多肽及其应用，具体是一种肿瘤特异性高表达小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽(亲和噬菌体)及其应用。

技术介绍

[0002]靶向治疗对于癌症患者有着至关重要的作用。小窝蛋白膜联蛋白Annexin A1在多种肿瘤组织中特异性高表达，而在健康组织中不表达，因此是一个固有的肿瘤靶点。但是，搜索文献发现尚未有报道过针对该靶点的靶向多肽，而主要是通过单克隆抗体来靶向肿瘤。单克隆抗体不仅制备技术复杂、容易产生免疫反应，而且价格昂贵，在生产应用中优势较弱。

技术实现思路

[0003]本专利技术利用丝状噬菌体M13的12肽库对小窝膜联蛋白AnnA1进行亲和筛选，获得了能够与AnnA1蛋白高度亲和的多肽序列，特异性强、便捷高效。同时，本专利技术将提供该亲和多肽及亲和噬菌体在肿瘤靶向治疗中的应用。
[0004]本专利技术采用以下技术方案。
[0005]一、一种亲和多肽：所述亲和多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.5之一。
[0006]所述亲和多肽能够特异结合AnnA1蛋白。所述亲和多肽能够高效亲和小窝膜联蛋白Annexin A1(以下简称AnnA1)，而Annexin A1在多种人类肿瘤中高表达，如乳腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌和前列腺癌。
[0007]SEQ ID No.1～SEQ ID No.5的氨基酸序列分别为：MHHHINRHHFVQ、MPMFKHRMFHTH、GHHKHGQIMPMS、MSHHKHNTNWSR、HPFLHWYNGQRT。如下表所示(表1)，亲和力高、特异性强。
[0008]表1 AnnA1亲和多肽氨基酸序列表
[0009][0010][0011]二、一种生物活性片段：所述的生物活性片段包含权利要求1所述亲和多肽，为生物活性片段中功能区的一部分，所述的生物活性片段也具有和所述亲和多肽一致的功能，即能够与AnnA1蛋白结合。生物活性片段在制备药物中应用。
[0012]三、一种亲和噬菌体，其外壳蛋白的序列选自或包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.6
之一。所述的外壳蛋白为侧壁、末端位置。
[0013]四、一种核苷酸序列：所述核苷酸序列能编码所述亲和多肽。
[0014]五、一种核苷酸序列：所述核苷酸序列能编码所述生物活性片段。
[0015]六、一种用于肿瘤靶向的复合纳米材料：所述复合纳米材料包含所述亲和多肽或者所述生物活性片段，也包含搭载抗肿瘤药物的纳米载体。
[0016]所述的多肽或生物活性片段作为靶向功能肽段，与能够载药的纳米颗粒或纳米纤维通过静电吸附或化学修饰的方法连接，作为肿瘤靶向复合纳米材料。
[0017]所述的药物为细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体药物、及其他类药物中的任意一种。
[0018]所述的药物载体为脂质体、金属或含有金属的纳米颗粒、天然或人工合成的高分子纳米材料、无机晶体材料、碳材料、聚合物囊泡、聚合物胶束中的任意一种。
[0019]七、一种用于肿瘤靶向的噬菌体复合材料：所述复合材料包含权利要求3所述亲和噬菌体，还包含在所述亲和噬菌体上基因工程化、化学修饰或物理吸附上其他材料，而形成更进一步的噬菌体。
[0020]本专利技术在研发、制备与生产用于肿瘤靶向治疗的生物医学材料中的应用。
[0021]本专利技术的多肽及对应噬菌体特异性强，亲和能力高，且操作相对简便。本专利技术的多肽可以和药物载体复合构成肿瘤靶向纳米材料，也可以直接用靶向噬菌体构建肿瘤靶向生物材料。
[0022]本专利技术的靶向多肽，包含以上多肽的生物活性片段，展示以上多肽的噬菌体以及偶联有以上多肽的其他生物纳米材料，均可以与抗癌药物结合形成复合纳米材料，有效靶向并治疗高表达AnnA1的肿瘤(乳腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌和前列腺癌)。经验证，多肽和靶向噬菌体与AnnA1结合力强，特异性高，为肿瘤的靶向治疗材料研发提供了新思路。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优势：
[0024](1)本专利技术筛选出的多肽能特异结合重组人小窝膜联蛋白AnnA1，而不结合其他蛋白，具有专一性。
[0025](2)本专利技术使用噬菌体展示技术筛选与AnnA1结合的小分子多肽，具有耗时较短，操作简便，成功率高的特点。
[0026](3)本专利技术筛选出的AnnA1亲和肽可以利用标准化的化学合成工艺进行合成，相比抗体类试剂，其生产、纯化、保存成本大大降低。
[0027](4)本专利技术筛选出的亲和肽或亲和噬菌体，能够靶向高表达AnnA1蛋白的多种肿瘤，为开发肿瘤靶向材料提供了广阔的思路，也为科研人员构建更有价值的能够治疗多种癌症的多功能靶向治疗材料提供了参考。
附图说明
[0028]附表1为实施例1每轮噬菌体文库筛选后获得噬菌体滴度统计结果。
[0029]附表2为实施例1第3、4轮噬菌体文库筛选获得亲和多肽频次统计结果。
[0030]附图1为实施例2噬菌体酶联免疫吸附实验(ELISA)结果统计图。
[0031]附图2为实施例3多肽体内靶向肿瘤验证实验成像图。
[0032]附图3为实施例4噬菌体体内靶向肿瘤验证实验统计结果图。
具体实施方式
[0033]下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释而本专利技术并不局限于以下实施例。凡在本专利技术的精神和原则之内，所做的任何更改和变化，均应当包括在本专利技术的保护范围之内。
[0034]本专利技术的实施例如下：
[0035]实施例1：利用噬菌体淘选技术筛选特异结合小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽。
[0036]a.目标蛋白的包被与封闭：将20μg小窝蛋白溶于50μL PBS和50μLNaHCO3的混合液，取一个新24孔板，用NaHCO3润湿其中一个孔后，加入蛋白混合液，在4℃湿盒中孵育过夜以包被目标蛋白。而后吸除剩余液，加5％BSA封闭液孵育2h，阻断非特异性结合位点；
[0037]b.噬菌体文库去背景：取10μL Ph.D.
‑
12噬菌体文库(1*10
13
pfu/ml)，用无菌PBS稀释至100μL。将稀释后的噬菌体文库加入24空板中，室温孵育1h，使噬菌体与孔板结合，去除背景；
[0038]c.噬菌体文库结合：吸除蛋白封闭液，用PBST洗涤6遍，加入去背景后的噬菌体，室温孵育1h，使噬菌体和蛋白充分结合；
[0039]d.洗涤：用PBST缓冲液洗涤孔板10次，以充分洗涤未结合的噬菌体；
[0040]e.洗脱：去除洗涤液，加入洗脱液(0.2M的甘氨酸
‑
盐酸，pH 2.2，1mg/mL BSA)室温孵育10分钟，将与蛋白特异性结合的噬菌体洗脱下来；
[0041]f.中和：加入中和液(1M 的Tris
‑
HCl，pH 9.1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽，其特征在于：所述亲和多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.1~ SEQ ID No.5之一。2.一种生物活性片段，其特征在于：所述的生物活性片段包含权利要求1所述亲和多肽。3.一种亲和噬菌体，其特征在于：所述亲和噬菌体的外壳蛋白的序列选自或包含SEQ ID No.1~ SEQ ID No.6之一。4.一种核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列编码权利要求1所述亲和多肽。5.一种核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列编码权利要求2所述生物活性片段。6.一种用于肿瘤靶向的复合纳米材料，其特征在于：所述复合纳米材料包含权利要求1所述亲和多肽或者权...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛传斌，缪瑶，杨明英，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：