生菜生育酚环化酶蛋白编码序列制造技术

一种基因工程技术领域的生菜生育酚环化酶蛋白编码序列，具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３中第６－１５２６位所示的核苷酸序列及其简并序列，该编码序列编码具有ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．４所示的氨基酸序列、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；利用该编码序列提高植物维生素Ｅ含量的方法包括如下步骤：将生菜生育酚环化酶蛋白编码序列连接于植物表达调控序列上，得到含生菜生育酚环化酶蛋白编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，利用该农杆菌转化拟南芥；通过抗生素筛选，获得含有生菜生育酚环化酶蛋白编码序列的转化细胞，最终再生转基因植株及其后代。本发明专利技术可提高蔬菜中维生素Ｅ的含量，实现维生素Ｅ的大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程
的蛋白编码序列，具体是一种生菜生育酚 环化酶蛋白编码序列。
技术介绍
维生素E是一种脂溶性维生素，其天然产物依结构的不同分为八种类型，分 别是a-生育酚、0-生育酚、Y-生育酚、S-生育酚(toc叩herol)和a、 p、 Y、 S-生育三烯酚(tocotrienol)，其中a -生育酚的生物活性最高，被认为 是维生素E的主要活性成分。维生素E对于提高机体免疫能力有着重要的影响， 具有抗衰老的功能，可以消除细胞色素沉淀，改善皮肤弹性，减弱性腺萎縮，因 而在大量保健品和美容用品中广泛使用。维生素E可以预防和治疗多种妇科疾 病，治疗早产儿溶血性贫血和蚕豆病，治疗营养不良儿童的巨幼红细胞性贫血。 维生素E可以促进胆汁分泌、胆管形成和胆红素分泌，对急慢性肝炎和肝硬化有 着治疗作用。维生素E可以预防癌症发生，对于癌症患者的治疗也有重要的辅助 作用。维生素E合成途径主要由以下五个步骤组成(1)4-羟苯丙酮酸(HPP)在 4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA) ; (2)尿黑酸在尿 黑酸植基转移酶(HPT)催化下，与植基二磷酸(PDP)发生縮合，生成2-甲基 -6-植基-苯醌；(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT) 的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌；(4)2,3-二甲基-6-植基-苯醌在生育 酚环化酶(TC)的催化下，生成Y-生育酚；(5) Y-生育酚在Y-生育酚甲基转 移酶(Y-TMT)的催化下，生成a-生育酚。本专利技术中，我们从菊科的生菜(Lactuca sativa)中克隆到了生育酚环化酶(tocopherol cyclase, TC)基因，并将该基 因转化拟南芥，证明它确实对植物中维生素E含量的提高有重要的作用。经对现有技术的文献检索发现，尚未见与生菜生育酚环化酶蛋白编码序列有 关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种生菜生育酚环化酶蛋白 编码序列。本专利技术可提高蔬菜中维生素E的含量，改善食物的营养品质，可以使 含生育酚环化酶蛋白编码序列的转基因植物成为生物反应器，进而实现维生素E 的大规模生产。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及一种生菜生育酚环化酶蛋白编码序列，该序列具有SEQ ID NO. 3 中第6-1526位所示的核苷酸序列及其简并序列。所述简并序列具体指，SEQ ID NO. 3中第6-1526位核苷酸中有一个或多个 密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代而产生的序列。根据所述生菜生育酚环化酶蛋白编码序列编码的多肽具有SEQ ID NO. 4所示 的氨基酸序列、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。本专利技术还涉及一种利用生菜生育酚环化酶蛋白编码序列提高植物维生素E 含量的方法，包括如下步骤步骤一，将生菜生育酚环化酶蛋白编码序列连于植物表达调控序列上，形成 含生菜生育酚环化酶基因的植物表达载体；步骤二，将步骤一中的表达载体转入农杆菌，通过浸花法转化拟南芥；步骤三，通过抗生素筛选，获得含有生菜生育酚环化酶基因的转化细胞并最 终再生转基因植株及其后代。本专利技术中，构建步骤一中含生菜生育酚环化酶基因的植物表达载体时可选用 本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本专利技术的生 菜生育酚环化酶蛋白多肽时，可以将生菜生育酚环化酶蛋白编码序列可操作地连 于表达调控序列，从而形成步骤一中的生菜生育酚环化酶蛋白表达载体。本专利技术中，步骤三含有生菜生育酚环化酶基因的转化细胞为真核细胞。常用 的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥和其它植物的生殖细胞或愈伤组织细胞。本专利技术具有如下的有益效果本专利技术可提高蔬菜中维生素E的含量，改善食 物的营养品质；同时本专利技术可使含生育酚环化酶蛋白编码序列的转基因植物成为 生物反应器，实现维生素E的大规模生产；利用本专利技术的生菜生育酚环化酶蛋白， 通过各种常规筛选方法，可筛选出与生育酚环化酶蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本专利技术中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌菌株GV3101，该菌株己在《Csaba Koncz， Jeff Schell; The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector, Mol Gen Genet, 1986, 204: 383-396》文献中公开。根癌农杆菌GV3101 可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号 为Gambar3。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明 本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例步骤一，生菜生育酚环化酶基因的克隆(1) RNA的提取取生菜叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf (EP) 离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA，用甲醛变性 胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。(2) 基因的全长克隆根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原 理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法进行cDNA全长克隆， 克隆使用Clontech试剂盒，克隆分三个阶段进行 ①首链cDNA的合成利用Clontech试剂盒所提供的5' -CDS primer A和SMART II A oligo引物， 以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5'-RACE -Ready cDNA;利用Clontech试剂盒所提供的3' -CDS primer A为引物，以所提 取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3'-RACE-Ready cDNA;② 3' -RACE用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的 基因特异引物2 (GSP2，见SEQ ID NO.l)进行3'-RACE PCR反应，用琼脂糖凝 胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体 上进行测序；③ 5' -RACE用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的 基因特异引物l (GSP1，见SEQ ID NO. 2)进行5'-RACE PCR反应。用琼脂糖凝 胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体 上进行测序。将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。BLAST 分析结果证明从生菜中得到的基因确为一个生育酚环化酶的相关基因；通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生菜生育酚环化酶蛋白编码序列，其特征在于，具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３中第６－１５２６位所示的核苷酸序列及其简并序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐岳立，唐克轩，任薇薇，王玥月，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]