本发明专利技术公开了一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒，包括以下步骤：１）将能与靶分子特异性结合的特异性ＤＮＡ与待检溶液混合，进行反应；２）将步骤１）的反应溶液与摩尔数为特异性ＤＮＡ的０．０１～１倍的纳米金溶液混合，进行反应；３）加入反应浓度在１０～６００ｍＭ之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。本发明专利技术在操作过程中，ＤＮＡ无需标记，无需昂贵仪器，只需通过观察纳米金溶液的颜色变化就可以判断靶分子是否存在，因此本发明专利技术简便、快捷、成本低廉、高特异性、高灵敏的检测任意靶分子，尤其适用于野外分析和高通量筛选，应用范围广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术特别涉及一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法及其试剂盒。
技术介绍
核酸适体(aptamer)是指利用上个世纪末建立而发展起来的SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)体夕卜蹄选技术,从随机寡核苷酸文库 中筛选获得的短单链寡核苷酸配基，它能够与靶分子特异结合，从而本身发生构象变化。通过体外筛选技术，理论上可筛选到任意物质的核酸适体，再加上高通量筛选的 技术特点与核酸适体精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得核酸适体在分析化学与生 物医药研究方面具有广阔的应用前景。例如，核酸适体在生物传感器的设计中具有重要作 用，被应用于生物学、环境、安全等领域的检测，包括蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多 肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K+、Hg2+、Pb2+等)，其他新的令人 兴奋的应用包括基于核酸适体的蛋白质芯片，和在蛋白质组学中用于高通量成像、基于DNA 酶和RNA酶的分子尺度的逻辑DNA分子计算机等。除此之外，还有一些其他的DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化。核 酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性 反应，从而本身发生构象的变化。这种核酸结构在遇到相应的靶分子进行结合时通常会伴有明显的构象变化。这种 结构的差异形成了基于核酸结构传感器的理论基础。一个典型的基于核酸结构的传感器包 括一个双标记的寡核苷酸序列(电子传递或能量传递的受体和供体)，因此，靶分子结合导 致的结构变化可以直接影响到受体和供体之间的距离，从而可以高灵敏度的检测到电信号 或光信号的产生。在此基础上，核酸结构在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点， 例如，Tan等将核酸适体应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方 法-分子aptamer信标(MAB)，并进一步用于凝血酶和血小板源生长因子(PDGF)的检测。 另外，由于核酸适体与抗体具有类似的特异结合性质，因此在ELISA、免疫学分析、Western 印迹法和生物传感器等许多应用中具有更大的发展潜力，并取得初步结果。纳米金颗粒在生物学中的应用非常广泛，目前，核酸结构-纳米复合物在分析检 测中的应用也受到了关注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作组分别报道了纳米 金-DNA复合物的重要应用，并将其发展为基于纳米结构的新型检测平台。通过深入了解金 胶独特的光学和电学性质，Mirkin等人随后发展了一系列方法对DNA和蛋白质进行超微量 检测。他们的方法依赖于巯基DNA探针在金胶表面的修饰，当加入靶时，可以引起金胶的团 聚或解聚，从而引起宏观上颜色的红_蓝变化。基于纳米金和核酸结构的分析检测方法也已受到关注。Huang等用纳米金颗粒 (GNPs)与核酸适体5’端的-SH直接作用形成的结合物(即Apt-AuNPs)来检测PDGF及其 受体(PDGFR)，发现由于Apt-AuNPs具有简易性和专一性，所以非常适合于蛋白质分析和癌 症诊断。Parlor等还将Apt-AuNPs用于光学检测凝血酶。Dwarakanath等将荧光性能优异的半导体纳米晶粒-量子点用于标记核酸适体，开辟了量子点技术与SELEX技术联合使用 的先河。Korgd等通过生物素和抗生物素的作用将前列腺专一性膜抗原(PSMA)的核酸适体 连接到具有近红外发光性能的CdTe量子点上来检测前列腺癌细胞，取得了较好的结果，这 给核酸适体量子点标记在活细胞及生物体内的分析检测提供了新思路。但是这些方法主要 是基于纳米金和HS-DNA的组装来进行的，由于DNA需要标记，而且组装的过程较为繁琐，耗 时长、成本高，不利于推广应用。 最近，Rothberg等人报道了一种利用未经过修饰的金胶检测靶DNA的比色法 (H. Li, L. Rothberg, PNAS 101,14036, September 28,2004) 该法基本原理是纳米金颗粒 可以和单链DNA，通过静电作用发生瞬时的吸附结合，从而可以在高离子强度条件下有效地 稳定纳米金，而双链DNA则不具有这种作用。但是该方法只对特定的DNA进行了检测，而不 适用于任意靶物质的检测。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是将现有的纳米金检测靶DNA的比色法扩展到 对不同的靶分子进行检测，借助于核酸适体和其他核酸结构对不同靶物质的特异性反应， 提供一种简便、快捷、成本低廉、通用型的纳米金检测靶物质的比色法及其试剂盒，可以很 方便地实现对任意靶物质的检测。本专利技术人经过研究发现，将纳米金作为核酸适体的比色探针，核酸适体本身为一 无规卷曲状态的柔性单链，它可以吸附在纳米金表面并有效的提高了纳米金的抗盐性能； 当核酸适体与靶发生特异性结合后，构象发生变化形成有序的立体机构，而这种有序DNA 结构不能吸附在纳米金表面，因此在提高溶液的离子强度后，没有靶分子的一组纳米金仍 然保持单分散状态，而有靶分子的一组中，纳米金发生了团聚而产生由红到兰的颜色变化； 因此，通过对纳米金颜色的观察，可以很方便地实现对靶物质的检测，从而完成了本专利技术。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种基于纳米金与核酸结构 的比色检测法，包括以下步骤1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与待检溶液混合，进行反应；2)将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0. 01 1倍的纳米金溶液混 合，进行反应；3)加入反应浓度在10 600mM之间的高盐溶液，观察溶液颜色变化。本专利技术可实现对蛋白质、有机小分子、金属离子、甚至整个病毒颗粒等非DNA分子 靶分子的检测。较佳的靶分子可为三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、血小板衍生性生 长因子(PDGF)、凝血酶(thrombin)、溶菌酶(lysozyme)、汞离子或氢离子(pH值)。本专利技术 所述的特异性DNA为核酸适体和一些其他的DNA序列，这些DNA序列也可以在某一特定环 境下发生构象变化，核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构， 可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。较佳的特异性DNA为核酸适体、特 异性结合钾离子的寡核苷酸(PSO)、特异性结合汞离子的寡核苷酸(MSO，mercury-specific Oligonuclide)或具有i_motif结构的寡聚核苷酸。根据本专利技术，步骤1)中较佳的，所述的 特异性DNA的反应浓度为1 50 μ M，待检溶液中靶分子的反应浓度为1 1000 μ Μ,待检 溶液中靶分子与特异性DNA的摩尔比为1 1 1 100。同常规，所述的反应较佳的可在缓冲溶液中进行，缓冲溶液较佳的为常规的Tris、PBS、柠檬酸或胂酸盐体系，缓冲溶液的反 应浓度较佳的为O 25mM。另外较佳的还可加入终浓度为O 600mM的NaCl或者0_50mM 的MgCl2以调节离子强度。反应温度较佳的为4 37°C，反应时间较佳的为1 30分钟。本专利技术步骤2)为将步骤1)的反应溶液与摩尔数为特异性DNA的0. 01 1倍的 纳米金溶液混合，进行反应。所述的纳米金较佳的为粒径10 20nm纳米金溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于纳米金与核酸结构的比色检测法，其特征在于，包括以下步骤：１）将能与靶分子特异性结合的特异性ＤＮＡ与待检溶液混合，进行反应；２）将步骤１）的反应溶液与摩尔数为特异性ＤＮＡ的０．０１～１倍的纳米金溶液混合，进行反应；３）加入反应浓度在１０～６００ｍＭ之间的盐溶液，观察溶液颜色变化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，王丽华，
申请(专利权)人：苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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