一种快速分子克隆方法技术

本文提供了一种基于T7 DNA聚合酶的快速不依赖于序列和连接酶的分子克隆（T7

【技术实现步骤摘要】
一种快速分子克隆方法


[0001]本专利技术涉及分子克隆方法，尤其是采用了T7 DNA聚合酶的不依赖于序列和连接酶的分子克隆(T7
‑
rSLIC)方法。

技术介绍

[0002]分子克隆对于生物医学、生物技术和合成生物学的研究至关重要。基于短同源末端序列的DNA体外组装是目前广泛使用的DNA组装技术。这类方法能够在体外酶促混合物中将DNA片段无缝组装到所需的环状质粒中，例如常用的Gibson组装。Gibson组装方法是在多酶混合物中利用T5核酸外切酶从5
’
端消化DNA片段，生成用于退火的ssDNA，利用Phusion高保真DNA聚合酶填充DNA缺口，利用Taq DNA连接酶修复DNA缺口。尽管其能够有效进行DNA克隆，但需要昂贵的酶试剂，另外反应过程较为耗时，例如一般需要在50℃条件下持续0.5
‑
3小时。本领域仍亟需简单、快速和低成本的分子克隆方法。

技术实现思路

[0003]在一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5
’
端的第一部分I5
’
和位于3
’
端的第二部分I3
’
，所述DNA片段II包括位于5
’
端的第一部分II5
’
和位于3
’
端的第二部分II3
’
，其中所述第二部分I3
’
和所述第一部分II5
’<br/>包括同源序列；2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生线性核酸分子，其中所述线性核酸分子从5
’
端到3
’
端依次包括所述第一部分I5
’
、所述同源序列以及所述第二部分II3
’
。
[0004]在一些实施方案中，所述同源序列的长度为15
‑
25个碱基。
[0005]在一些实施方案中，所述第二部分I3
’
由所述同源序列和位于所述同源序列3
’
端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分II5
’
由所述同源序列和位于所述同源序列5
’
端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。
[0006]在一些实施方案中，所述第一冗余序列和/或第二冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。
[0007]在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。
[0008]在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。
[0009]在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。
[0010]在另一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5
’
端的第一部分Ia、位于3
’
端的第二部分Ib以及位于所述第一部分Ia和所述第二部分Ib之间的第三部分Ic， 所述
DNA片段II包括位于5
’
端的第一部分IIa、位于3
’
端的第二部分IIb以及位于所述第一部分IIa和所述第二部分IIb之间的第三部分IIc，其中所述第二部分Ib和所述第一部分IIa包括第一同源序列，所述第二部分IIb和所述第一部分Ia包括第二同源序列；2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生环形核酸分子，其中所述环形核酸分子包括依次连接的所述第三部分IIc、所述第二同源序列、所述第三部分Ic以及所述第一同源序列。
[0011]在一些实施方案中，所述第一同源序列和/或所述第二同源序列的长度为15
‑
25个碱基。
[0012]在一些实施方案中，所述第二部分Ib由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列3
’
端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分IIa由所述第一同源序列和位于所述第一同源序列5
’
端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。
[0013]在一些实施方案中，所述第二部分IIb由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列3
’
端的第三冗余序列组成，和/或所述第一部分Ia由所述第二同源序列和位于所述第二同源序列5
’
端的第四冗余序列组成，其中所述第三冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第四冗余序列。
[0014]在一些实施方案中，所述第一冗余序列、第二冗余序列、第三冗余序列、和/或第四冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。
[0015]在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。
[0016]在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。
[0017]在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。
[0018]在另一方面，本文提供了一种分子克隆方法，包括：1) 提供三个或三个以上的DNA片段，其中待连接的任意两个DNA片段的临近末端包括同源序列；2) 让所述DNA分子在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生组装了所述DNA片段的组装核酸分子。
[0019]在一些实施方案中，所述同源序列的长度为15
‑
25个碱基。
[0020]在一些实施方案中，所述DNA片段在所述DNA片段在所述同源序列的末端方向还包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基的冗余序列。
[0021]在一些实施方案中，所述反应混合物中不包括DNA连接酶。
[0022]在一些实施方案中，所述反应混合物中还包括白蛋白。
[0023]在一些实施方案中，所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。
[0024]在一些实施方案中，所述组装核酸分子为线性DNA分子或环形DNA分子。
附图说明
[0025]图1本文提供的T7
‑
rSLIC方法示意图。
[0026]图2单片段与线性化的载体骨架组装示意图。
[0027]图3通过电泳和测序显示单片段组装结果。(A) 电泳图，其中泳道M表示100 bp Plus DNA ladder；泳道1显示目的序列菌落PCR产物(2998 bp)；泳道2显示了载体骨架菌落PCR产物(阴性样本)；(B) 菌落PCR结果呈阳性的质粒测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分子克隆方法，包括：1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5
’
端的第一部分I5
’
和位于3
’
端的第二部分I3
’
，所述DNA片段II包括位于5
’
端的第一部分II5
’
和位于3
’
端的第二部分II3
’
，其中所述第二部分I3
’
和所述第一部分II5
’
包括同源序列；2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在T7 DNA聚合酶存在下接触，形成反应混合物；以及3) 用所述反应混合物转染宿主细胞，以在所述宿主细胞内产生线性核酸分子，其中所述线性核酸分子从5
’
端到3
’
端依次包括所述第一部分I5
’
、所述同源序列以及所述第二部分II3
’
。2.如权利要求1所述的分子克隆方法，其中所述同源序列的长度为15
‑
25个碱基。3.如权利要求1或2所述的分子克隆方法，其中所述第二部分I3
’
由所述同源序列和位于所述同源序列3
’
端的第一冗余序列组成，和/或所述第一部分II5
’
由所述同源序列和位于所述同源序列5
’
端的第二冗余序列组成，其中所述第一冗余序列在核苷酸序列上不同于所述第二冗余序列。4.如权利要求3所述的分子克隆方法，其中所述第一冗余序列和/或第二冗余序列的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个碱基。5.如权利要求1所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中不包括DNA连接酶。6.如权利要求3所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中还包括白蛋白。7. 如权利要求4所述的分子克隆方法，其中所述反应混合物中所述T7 DNA聚合酶的浓度在0.05至0.3 U/μL。8.分子克隆方法，包括：1) 提供DNA片段I和DNA片段II，所述DNA片段I包括位于5
’
端的第一部分Ia、位于3
’
端的第二部分Ib以及位于所述第一部分Ia和所述第二部分Ib之间的第三部分Ic， 所述DNA片段II包括位于5
’
端的第一部分IIa、位于3
’
端的第二部分IIb以及位于所述第一部分IIa和所述第二部分IIb之间的第三部分IIc，其中所述第二部分Ib和所述第一部分IIa包括第一同源序列，所述第二部分IIb和所述第一部分Ia包括第二同源序列；2) 让所述DNA片段I、DNA片段II在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成，王锡衍，王端阳，
申请(专利权)人：北京因诺惟康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：