抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用制造技术

白蛋白是人血清中的主要蛋白。本发明专利技术公开了两个抗人血清白蛋白的纳米抗体，以及它们的表达、纯化和鉴定。抗人血清白蛋白的纳米抗体在生物医药中有广泛的应用，不仅可以用于白蛋白的分离纯化，还可以用于免疫检测、临床诊断和药物治疗。和药物治疗。和药物治疗。

【技术实现步骤摘要】
抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体技术和生物医药领域，特别是将纳米抗体应用于蛋白纯化，应用于检测、诊断和治疗。

技术介绍

[0002]人血清白蛋白（Human Serum Albumin，简称HSA）在人血液中含量丰富，浓度约为42 g/L，占血液总蛋白的60%左右。在血液中，人血清白蛋白可以结合各种分子和离子（如脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子、药物分子等），同时维持血液正常的渗透压。在临床上，人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故等大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。
[0003]人血清白蛋白是单链多肽，由585个氨基酸构成，分子量为66 kDa。基于人血清白蛋白的大量需求，人们对重组人血清白蛋白进行了深入的研究，目前报道的重组表达系统有多种，包括大肠杆菌、毕赤酵母、水稻、烟草叶绿体、牛、猪、等。重组人血清白蛋白不仅需要产量高、生产成本低，在生理生化性质、物理结构、生物学功能、免疫原性等也要与血液来源的人血清白蛋白一致。高纯度的重组人血清白蛋白产品有很大的市场需求。
[0004]抗体对抗原具有特异性结合的能力，能够识别不同的蛋白，在生物医药领域有广泛的应用，市场上不乏针对人血清白蛋白的抗体。在蛋白的分离纯化方面，抗体可以与层析介质偶联，做成分离目标蛋白的亲和层析柱，例如用抗人血清白蛋白的抗体做成的亲和层析柱来制备高纯度的人血清白蛋白产品。在检测方面，食品安全监管需要及时检测农药残留、非法添加物等，各种基于免疫层析原理的快速检测条由于简单、方便、快速、价廉，在食品监管上发挥了巨大作用。在临床诊断方面，免疫检测是重要的检测技术，具体的实例是目前广泛应用的新冠抗原检测，利用针对新冠病毒的核蛋白（N protein）的两个抗体，采用双抗夹心法，制备成免疫层析快速检测条，定性或定量地检测新冠病毒的存在。在治疗药物方面，抗体已经成为重要的药物种类，不仅抗体本身可以作为药物，而且抗体药物还包括了由抗体衍生的抗体
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毒素蛋白偶联体（immunotoxin）、抗体
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药物偶联体（antibody
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drug conjugate, ADC）、双抗和多抗（bispecific antibody, multi
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specific antibody），等。
[0005]抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体由免疫动物产生，为抗体的混合物，各批次间的抗体组成不同，效价有差异。单克隆抗体由单一基因产生，克服了多克隆抗体的批间次差异的问题。但单克隆抗体存在以下特点和不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高，在机体内不易被清除，穿透能力弱。
[0006]纳米抗体是常规抗体的简化形式，早期在羊驼等动物的抗体中发现一种只有重链的抗体，通过仅保留与抗原结合的单个结构域，构建成为大小在纳米级别的纳米抗体，又称为单域抗体。纳米抗体保留了常规抗体对抗原的高亲和性和高特异性，还有以下优点：单个结构域的稳定性高；能够在原核或真核细胞中高效表达；在原核细胞表达时，生长周期短、制备成本低；对人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障。纳米抗体在生物医药中得到了越来越广泛的应用，如获批上市的双特异性纳米抗体Ozoralizumab，
利用抗人血清白蛋白的纳米抗体对白蛋白的高亲和性，来延长在体内的存留时间，同时利用另一个融合在一起的抗肿瘤坏死因子TNFα的纳米抗体，靶向药物作用分子，用于治疗类风湿性关节炎。
[0007]蛋白分离纯化，包括抗体蛋白的分离纯化，有巨大的需求。虽然原理上抗体可以用于制备分离纯化抗原蛋白的亲和层析柱，但由于常规抗体的稳定性差、生产成本高，用抗体制备的亲和层析柱至今并没有得到广泛的应用。以抗体蛋白的纯化为例，普遍用的还是蛋白A制备的亲和层析柱。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供两种抗人血清白蛋白的纳米抗体，该纳米抗体对人血清白蛋白具有高亲和力和特异性，可以用于制备分离纯化人血清白蛋白的亲和层析柱，可以用于检测和诊断试剂盒的研发，具有良好的应用前景。
[0009]一般来讲，纳米抗体的氨基酸序列由大约110
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130个氨基酸残基组成，有四个骨架区（FM1
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4）和三个互补决定区（CDR1
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3），按顺序交错排列构成。本专利技术公布了两个抗人血清白蛋白的纳米抗体2p和4p，它们具有相似的四个骨架区和不同的三个互补决定区氨基酸序列。纳米抗体的互补决定区是特异性识别抗原的关键结构。纳米抗体2p的互补决定区分别由SEQ ID NO: 1对应其CDR1、SEQ ID NO: 2对应其CDR2、SEQ ID NO: 3对应其CDR3。同样的，纳米抗体4p的互补决定区分别由SEQ ID NO: 4对应其CDR1、SEQ ID NO: 5对应其CDR2、SEQ ID NO: 6对应其CDR3。
[0010]本专利技术公布的两个抗人血清白蛋白的纳米抗体2p和4p，除了三个互补决定区对抗原的识别起决定性作用外，四个骨架区对互补决定区的空间结构有影响、进而影响对抗原的识别。因此，纳米抗体2p和4p的完整氨基酸序列也是决定抗原识别的重要结构基础。2p的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，4p的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
[0011]本专利技术公布的两个抗人血清白蛋白的纳米抗体分别含有115和124个氨基酸残基，形成该纳米抗体的核心结构。纳米抗体的核心结构本身，在不增加氨基酸残基的情况下，具有与所述抗原蛋白的高亲和性和高特异性。然而在实际应用中，纳米抗体常以融合蛋白的形式存在，即在纳米抗体的核心结构的N末端或C末端加上氨基酸残基、多肽和蛋白，形成融合蛋白，在保留原本纳米抗体的高亲和性和高特异性的同时，赋予融合蛋白更多的特性和功能。例如：在其N端加上甲硫氨酸来引入基因表达的起始编码（ATG），或加上信号肽来将表达的蛋白导入周质空间（periplasmic space）；在其C末端与作为蛋白标签（如组氨酸标签、人流感血凝素标签）的多肽融合，使其能够用镍柱进行纯化、用抗人流感血凝素抗体进行鉴定；与荧光蛋白融合使得能够显色和显荧光用于示踪；与细胞毒蛋白融合成为免疫毒素（immunotoxins）用于治疗等。
[0012]对纳米抗体在蛋白基因水平加以修饰、构建融合蛋白，是纳米抗体相对于常规抗体的明显优势，有成熟的分子生物学方法，也是常见的纳米抗体具体体现的形式。可以与纳米抗体融合的多肽和蛋白多种多样，包括各种蛋白标签（组氨酸标签His，人流感病毒血凝素标签HA，FLAG标签，麦芽糖结合蛋白MBP标签、Myc标签、等）、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、发光酶、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、抗体Fc片段、等。编码纳米抗体2p与组氨酸标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 9所示，编码纳
米抗体4p与组氨酸标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗人血清白蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1, CDR2, CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 1
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3或SEQ ID NO: 4
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6所示。2.抗人血清白蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7或8所示。3.纳米抗体与多肽或蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽和蛋白的融合部分：蛋白标签、碱性磷酸酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、和抗体Fc片段。4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的融合部分为：（a）组氨酸蛋白标签，（b）麦芽糖结合蛋白，或（c）谷胱甘肽转移酶。5.编码纳米抗体融合蛋白的核酸序列，其特征在于，（a）含有权利要求4所述的纳米抗体融合蛋白，（b）缺失信号肽，导致融合蛋白表达在细胞浆内，...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶其壮，王梓杨，赖文珊，杨小乐，郭媛媛，肖利群，
申请(专利权)人：广州明药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：