重组载体和制备μ-芋螺毒素的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种重组载体和制备μ

【技术实现步骤摘要】
重组载体和制备
μ
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芋螺毒素的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组载体和制备μ
‑
芋螺毒素的方法。

技术介绍

[0002]芋螺毒素肽是由芋螺属软体动物分泌的一类神经毒素，富含活性二硫键，广泛作用于包括离子通道、G蛋白偶联受体、转运体和酶等靶标。根据其对神经肌肉系统的作用部位，主要分为4类：(1)作用于乙酰胆碱受体(AchR)的α
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芋螺毒素；(2)在活化相起作用、作用于钠离子通道的μ
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芋螺毒素；(3)抑制Cav2.2通道的ω
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芋螺毒素；(4)在非活化相起作用、作用于钠离子通道的δ
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芋螺毒素。
[0003]近年来发现，芋螺毒素可以作为临床药物或者新药导向化合物，并且μ
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芋螺毒素还可以作为抗皱因子应用于化妆品中。如何获得足量、高纯度的芋螺毒素成为制约芋螺毒素在医药和化妆品等领域应用的关键因素。
[0004]目前，天然提取和化学合成是芋螺毒素的主要获得途径，但天然提取效率低，而化学合成多肽的成本高，并且芋螺毒素富含二硫键，人工合成难度大，因此通过微生物细胞工厂进行芋螺毒素肽的表达为芋螺毒素的规模生产提供了新的途径。然而，一方面由于芋螺毒素通常为氨基酸残基数不超过50的短肽，而且富含二硫键，使得其活性受到二级结构影响很大，另一方面，芋螺毒素本身具有毒性，从而使得其在采用微生物细胞工厂进行表达生产过程中容易对宿主细胞造成不利影响，或者会被宿主细胞作为有害物质降解，导致采用常规生物表达方式不能顺利生产芋螺毒素。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的难以大量生产高纯度芋螺毒素等问题，提供一种重组载体和制备μ
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芋螺毒素的方法。本专利技术提供的重组载体能够编码GST蛋白标签和μ
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芋螺毒素的融合蛋白，该融合蛋白相比于μ
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芋螺毒素而言对细胞的毒性显著降低，从而使其能够顺利采用大肠杆菌等本领域常用的生物表达宿主细胞进行生产。另一方面，本专利技术提供的重组载体中还插入了肠激酶识别序列，使得后续GST蛋白标签和μ
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芋螺毒素的切割以及μ
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芋螺毒素的回收更为方便。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种用于生物表达μ
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芋螺毒素融合蛋白的重组载体，所述重组载体依次包括GST标签编码基因、肠激酶识别序列编码基因和μ
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芋螺毒素编码基因。
[0007]本专利技术第二方面提供由如上第一方面所述的重组载体表达获得的μ
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芋螺毒素融合蛋白。
[0008]本专利技术第三方面提供一种制备μ
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芋螺毒素的方法，所述方法包括将第一方面所述的重组载体引入表达体系中进行生物表达。
[0009]通过上述技术方案，本专利技术能够取得如下有益效果：
[0010](1)本专利技术通过将GST标签与芋螺毒素进行融合表达的方式，解决了芋螺毒素分子
量小且具有一定毒性，从而难以采用生物表达的方式进行生产的问题。同时，通过在GST标签与芋螺毒素之间引入肠激酶识别序列的方式，在后续对融合蛋白进行切割，从而能够简单方便地制备出无其他冗余氨基酸的芋螺毒素短肽。
[0011](2)本专利技术提供的重组载体在导入现有常规的微生物表达宿主(如大肠杆菌等)后，能够成功高效表达出氨基酸序列及二级结构均正确的μ
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芋螺毒素。通过对表达产物进行简单的纯化、切割和分离处理后即可获得高纯度μ
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芋螺毒素，实现了μ
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芋螺毒素的高效批量生产，十分适合推广应用。
附图说明
[0012]图1是实施例1中构建的重组载体Pex
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N
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GST
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enterokinase
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CnIIIC的质粒谱图。
[0013]图2是实施例1中对构建的重组载体的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证的结果图。
[0014]图3(a)
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(c)是实施例2中对GST
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enterokinase
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CnIIIC融合蛋白粗蛋白溶液、切割产物溶液、GST
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enterokinase溶液、回收肠激酶溶液和分离出的CnIIIC溶液进行SDS
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PAGE检测的结果图。
具体实施方式
[0015]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0016]芋螺属生物体内合成芋螺毒素时通常是先翻译合成一个具有70
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120个氨基酸残基的多肽前体，其可分为三个部分：信号肽(pre区)、前体肽(pro区)和成熟肽区，经过加工后，再将成熟肽区切分下来，从而形成具有生物活性的芋螺毒素。因此，本领域采用基因工程等生物学方法进行芋螺毒素的生物表达时通常期望通过宿主细胞直接表达芋螺毒素成熟肽，从而能够更加高效地获取芋螺毒素。但是，研究表明，采用生物表达的方式生产芋螺毒素时，一方面由于芋螺毒素本身的毒性易对宿主细胞的正常生长和代谢造成不利影响。另一方面，芋螺毒素(成熟肽)通常为分子量很小的短肽，其氨基酸残基数量一般不超过50，对于μ
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芋螺毒素而言更是只有20
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30个氨基酸残基，但是其二级结构却较为复杂，通常富含二硫键，翻译后加工的过程对于获得具有活性的芋螺毒素十分重要。因此，目前采用大肠杆菌等常见的工程菌对芋螺毒素(成熟肽)进行生物表达十分困难。也有一些研究人员通过采用串联表达或将芋螺毒素与其他蛋白进行融合表达的方式实现了芋螺毒素的生物表达。但是，串联表达获得的是芋螺毒素成熟肽氨基酸序列多次重复串联的产物，对表达产物进行纯化后还需要再进行化学切割、二次纯化等操作，而且由于切割后的产物是目标芋螺毒素与目标芋螺毒素重复串联表达产物的混合物，因此对二次纯化选用的方式具有较高的要求。此外，串联表达虽然解决了芋螺毒素对于宿主细胞的毒性问题，但是仍面临着翻译后修饰是否正确，化学切割对于芋螺毒素本身的结构是否造成影响，以及化学切割后的产物二级结构是否正确等问题，使得产物的活性具有很大的不确定性。同理，采用其他蛋白与芋螺毒素进行融合表达也与串联表达具有类似的问题，使得芋螺毒素(成熟肽)的生物表达生产
仍面临挑战。
[0017]本专利技术的专利技术人在研究中发现，通过将μ
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芋螺毒素与特定的蛋白标签相连进行(融合)表达时，一方面能够降低μ
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芋螺毒素对于宿主细胞的毒性，避免其影响宿主细胞的生长代谢，另一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生物表达μ
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芋螺毒素的重组载体，其特征在于，所述重组载体依次包括GST标签编码基因、肠激酶识别序列编码基因和μ
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芋螺毒素编码基因。2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述GST标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或，所述肠激酶识别序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述μ
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芋螺毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。3.根据权利要求2所述的重组载体，其中，所述GST标签编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或，所述肠激酶识别序列编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或，所述μ
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芋螺毒素编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。4.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体选用pEX质粒、pGH质粒、pET质粒、pLST质粒、pTST质粒、pEST质粒、pBAD质粒、pTC质粒、pTG质粒、pTFN质粒和pLAS质粒中的至少一种作...

【专利技术属性】
技术研发人员：江俊杰，李榕榕，王靖，于淼，
申请(专利权)人：山东天晟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：