与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用，属于分子育种领域。本发明专利技术利用1份松散型花椰菜育种高代自交系材料及其EMS突变体库中的矮茎材料，基于BSA群体定位获得与松散型花椰菜矮茎性状紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发了分子标记。根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对428个单株进行基因型鉴定，与表型符合率达到100％。本发明专利技术可以直接用于松散型花椰菜矮茎植株的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程；同时为矮茎基因CauSS的克隆、功能验证及植物主茎生长、发育等相关研究奠定基础。等相关研究奠定基础。等相关研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用


[0001]本专利技术属于花椰菜分子育种领域，涉及一种与花椰菜矮茎基因连锁的SNP分子标记及应用。

技术介绍

[0002]花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L.)属于十字花科芸薹属植物，由于其营养丰富，深受广大消费者的喜爱。目前我国已成为世界上最大的花椰菜生产国和消费国，花椰菜在保证我国蔬菜出口创汇和周年均衡供应中起重要作用。近年，松散型花椰菜(简称松花菜)已成为我国主要消费类型，栽培面积占总面积的90％以上，为我国农业增效、农民增收提供了重要保障。
[0003]随着人工成本的增加，选育适宜机械化采收的品种显得尤为迫切。目前，机械化采收已经成为松花菜主要育种目标之一。松花菜主茎长度是实际生产与生长发育过程中重要的农艺性状之一。主茎过高俗称“高脚”，植株容易倒伏，不利于田间管理；主茎过矮俗称“矮脚”，不利于机械化采收。适当的主茎长度不仅有利于机械化采收，而且有助于花球远离土壤中的病原微生物，对花球的健康发育和品质保障具有积极作用。
[0004]目前国内外尚未见花椰菜主茎长度基因的定位、克隆等研究，花椰菜高矮茎形成机制尚不明确，不利于现有花椰菜品种的遗传改良。因此，在开展高矮茎的遗传分析与基因克隆基础上，阐明其目标基因的功能及其相关的分子调控机制，对花椰菜种质创新、品种改良具有重要的理论意义和实际应用价值。
[0005]在前期研究中，我们发现了1个松散型花椰菜矮茎突变体
‘
SS
‑5‑
>16
’
，本专利技术以该突变体为主要材料，开展了矮茎基因的定位及连锁分子标记的开发。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于针对松散型花椰菜出现的高矮茎现象，提供一种与矮茎基因连锁的分子标记，为矮茎突变体的筛选提供新的途径。
[0007]一种与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记，为花椰菜9号染色体第1732384位核苷酸处G向A的突变。
[0008]进一步的，所述的分子标记对应的基因型：A：A为具有矮茎表型的基因型，G：A和G：G为不具有矮茎表型的基因型。
[0009]进一步的，针对该突变位点设计的引物(Cau
‑
SS1标记)如下：
[0010]正向引物Primer_AlleleX(SS
‑
1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG(SEQ ID NO.1)；
[0011]正向引物Primer_AlleleY(SS
‑
2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA(SEQ ID NO.2)；
[0012]反向引物Primer_Common：CAATGGCTGCAATACCATCAGTAG(SEQ ID NO.3)；
[0013]进一步的，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列FAM和HEX。
[0014]接头序列：
[0015]FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
[0016]HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；
[0017]荧光接头序列为FAM或HEX(LGC公司合成)。优选：连接了FAM荧光接头序列的正向引物SS
‑
1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG；连接了HEX荧光接头序列的正向引物SS
‑
2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA。
[0018]本专利技术的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于松散型花椰菜高矮茎的选育，且为克隆矮茎基因、研究植物茎生长和发育的分子机制奠定基础。具体如下：
[0019]所述的分子标记用于鉴定和辅助筛选松散型花椰菜高矮茎。
[0020]进一步的，所述的分子标记用于松散型花椰菜高矮茎筛选育种，尤其是矮茎突变体的筛选。
[0021]进一步的，所述的分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。
[0022]具体包括以下步骤：
[0023](1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0024](2)对扩增产物进行检测与分析。
[0025]进一步的，对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS
‑
2对应的荧光信号，则检测位点为A：A基因型，判定为具有矮茎表型的纯合突变体单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物SS
‑
1对应的荧光信号，则检测位点为G：G基因型，判定为不具有矮茎表型的纯合野生单株(高茎表型)；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物SS
‑
1和SS
‑
2对应的两种荧光信号，则检测位点为G：A基因型，判定为不具有矮茎表型的杂合野生单株(高茎表型)。
[0026]进一步的，所述的分子标记应用时，采用Touchdown PCR。
[0027]进一步的，Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃
‑
56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
[0028]另外，包含上述分子标记引物的试剂盒，可以用于鉴定花椰菜矮茎性状，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物的试剂做成试剂盒。
[0029]用于检测所述分子标记是否存在的试剂在花椰菜矮茎基因CauSS定位中的应用，扩增所述分子标记引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。利用本专利技术的分子标记，可以对花椰菜矮茎基因CauSS进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。
[0030]本专利技术还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本专利技术的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本专利技术还保护含有所述重组载体的重组细胞。
[0031]本专利技术的优点：
[0032]本专利技术利用BSA群体定位结合传统遗传连锁分析，定位到一个与松散型花椰菜矮茎基因连锁的标记，该突变位点位于9号染色体的1732384处，开发了与该松散型花椰菜矮茎基因相关联的KASP分子标记，可以直接用于松散型花椰菜高矮茎表型和对应基因型的鉴定，进
而依赖该分子标记进行辅助育种，加快育种效率。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到目标植株，有效地减小了种植规模，减少了后期田间鉴定的工作量，提高了选择的效率和准确性。本专利技术在松散型花椰菜高矮茎育种实践及植物茎生长和发育相关理论研究上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记，其特征在于，为花椰菜9号染色体第1732384位核苷酸处G向A的突变。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记对应的基因型：A：A为具有矮茎表型的基因型，G：A和G：G为不具有矮茎表型的基因型。3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，针对突变位点设计的分子标记引物如下：正向引物SS
‑
1：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAG
‑3’
；正向引物SS
‑
2：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGATCGCTGCTTCGTTTAA
‑3’
；反向引物Primer_Common：5
’‑
CAATGGCTGCAATACCATCAGTAG
‑3’
。4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列；正向引物SS
‑
1的5
’
端连接FAM荧光接头序列，正向引物SS
‑
2的5
’
端连接HEX荧光接头序列；FAM和HEX荧光接头序列分别为：FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。5.权利要求1
‑
4任一项所述的分子标记在鉴定或辅助...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小丽，王晓武，孙德岭，武剑，单晓政，粱建丽，文正华，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：