制备脂质体的方法技术

公开了无尺寸排除步骤的制备脂质体的方法及其组合物，该方法获得显示窄尺寸分布的小尺寸脂质体。该方法以lyso

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备脂质体的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求在2020年7月1日提交的美国临时专利申请No.63/047,068的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术是在国家卫生研究院授予的合同编号为HL070227的政府支持下完成的。政府享有本专利技术的一定的权利。

技术介绍

[0005]脂质体是由脂质双层构成的封闭结构。该双层封闭了水相(内部水相)。目前制备脂质体的方法通常以乳化步骤开始，其中含有溶解在有机溶剂中的脂质的油相与水相混合并搅拌。然后该有机溶剂被蒸发，留下含有脂质体的水溶液。然而，通过这种流程制备的脂质体是尺寸不一的群体，并且通常较大(1微米及以上)。需要较小的脂质体时，为了减小尺寸，实施过滤或挤压步骤。然而，过滤和挤压会导致脂质损失，影响脂质体的装载效率。此外，挤压步骤在制造过程中带来了挑战，并且不容易实现规模化。

技术实现思路

[0006]本公开提供了用于制备脂质体组合物和方法，该方法无尺寸排除(size exclusion)步骤，但仍能产生与使用尺寸排除步骤的方法可比的具有窄尺寸分布的小尺寸脂质体。尺寸排除步骤的去除通过使用lyso
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PS实现。避免尺寸排除步骤使得脂质损失减少，并有利于制造过程。
附图说明
[0007]图1显示了PS的暴露与脂质浓度的函数关系。
[0008]图2显示了由单独的PC、含有双链PS的PC和含有lyso
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PS的PC组成的脂质体的示意图。
具体实施方式
[0009]本公开提供了制备脂质体组合物的方法，该脂质体组合物适于递送蛋白质/肽，从而实现免疫耐受的诱导。脂质体的制备方法使用了材料，因此在整个过程中不需要尺寸排除步骤，并且仍能够获得小尺寸、均匀分布的脂质体群体。在制备脂质体组合物的制造过程中，消除尺寸排除步骤是有利的。
[0010]在本申请中，单数形式的使用包含复数形式，反之亦然。例如，“一个(a)”或“一个(an)”也包括多个所指的条目，除非另有说明。
[0011]本说明书中给出的每个数值范围都包括其上限值和下限值，以及属于其范围内的每个较窄数值范围，如同这些较窄的数值范围都被在此明确写出。
[0012]“脂质结构”是指脂质体和其他结构，例如胶束结构、脂质体、cochleate、分子组装
体等。
[0013]当本文中的术语“lyso”与磷脂结合使用时是指分子的甘油部分只有一个酰基链而不是两个酰基链。例如，lyso
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PS只有一个酰基链，而PS有两个酰基链。
[0014]“脂质体”在本文中可被认为是脂质纳米粒子或纳米粒子。脂质体可以包括PC和PS，其中部分或所有PS是lyso
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PS的形式。脂质体可以含有PS、lyso
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PS和PC作为仅有的磷脂。脂质体可以含有lyso
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PS和PC作为仅有的磷脂。PS或lyso
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PS可以在双层的总磷脂的10％至30％的范围内，其余磷脂主要是PC或仅是PC。例如，lyso
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PS可以占10至50％，或15至50％，或者15至30％，剩余的磷脂是PC。脂质体具有的PC：lyso
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PS的比例可以是90∶10、80∶20、70∶30、60∶40或50∶50的摩尔比。只有PS(部分或全部)是lyso
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PS的形式，而所有PC都有两个酰基链。在一个实施例中，磷脂酰乙醇胺(PE)可以被添加。可以以PC为代价添加PE，添加量最多为20摩尔％。
[0015]在各种示例中，脂质体不含任何PG。用于制备脂质体的磷脂可从任何可用来源获得，例如植物或动物。磷脂是市售的或可通过已知方法合成的。例如，PS可从猪脑PS或植物基大豆(例如大豆)PS获得。lyso
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PS也是市售的。
[0016]PC可以具有14至20个碳(以及所有整数个碳以及它们之间的范围(例如，14、15、16、17、18、19或20))。在各种示例中，PC不是lyso
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PC。
[0017]lyso
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PS的酰基链可以具有16至20个碳(例如，16、17、18、19或20)。它应该具有至少一个双键。例如，它可以是18:1。它可能具有2或3个双键。不意图受任何特定理论的约束，具有单个双键的脂质体的稳定性被认为可能比具有2或3个双键的更好。然而，发现了至少有一个双键对于增强效能是所必需的。PC和lyso
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PS的链长度可以相同或不同。
[0018]在一个实施例中，PC:PS的比例为90:10至60:40，包括它们之间的所有比例值和范围，并且所有PS均为lyso
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PS。在一个示例中，PC:lyso
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PS可以是85:15到65:35，包括它们之间的所有比例值和范围。在一个实例中，PC:lyso
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PS的比例可以是70:30(摩尔比)。在一个实施例中，lyso
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PS占15至50％(包括它们之间的所有比例值和范围)或15至35％(包括它们之间的所有比例值和范围)，剩余的磷脂为PC。lyso
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PS和PC可以是脂质体双层中存在的仅有的磷脂。在一个实施例中，lyso
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PS可以高达脂质体总磷脂的90％，剩余为PC。在各种其他实施例中，一些PC可以用PE代替。
[0019]lyso
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PS在脂质体制备中的使用，惊奇地获得了小尺寸和均匀尺寸的脂质体群体，即使没有尺寸排除步骤(如挤压)。不使用尺寸排除步骤制备脂质体的方法如下。过程涉及薄脂质膜水合，其使用期望摩尔比的磷脂，例如lyso
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PS和PC。脂质可溶解在有机溶剂中，例如氯仿或乙醇或甲醇或异丙醚，并使溶剂干燥。然后lyso
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PS、PC膜在适当的缓冲液如(Tris、柠檬酸盐、PBS等)中被再水合。上述步骤可在室温进行。然后组合物可在高于室温的温度，例如37℃，孵育一段短暂的时间(例如30秒至5分钟)，然后涡旋(大约30秒至3分钟)。该过程可以重复。例如，该过程可以重复2至5次。涡旋可由等效的可选混合方案代替，例如，例如，温和混合、旋转、振荡等或其组合。
[0020]脂质粒子不需要挤压或进行任何其他尺寸排除过程(例如密度梯度、超声等)，并且优选地不进行挤压或其他尺寸排除步骤。相反，脂质粒子可以直接用于与蛋白质的缔合/装载。在一个实施例中，蛋白质可以通过触发装载(trigger loading)过程被装载，由此增加温度以改变蛋白质的构象。然后构象改变的蛋白质被结合到脂质体中，并且一旦冷却到
室温就恢复到其原始构象，但现已被结合到脂质双层中。
[0021]在一个实施方案中，脂质体还可以包括免疫调节剂，如雷帕霉素和/或维甲酸。免疫调节剂的添加可以在干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备具有小于300nm的平均直径的脂质体的方法，其中至少95％的粒子具有200
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275nm的直径，包括：混合包括磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰丝氨酸(lyso
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PS)的多种脂质，其中PC与lyso
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PS的比例为90:10至60:40；和涡旋混合物，其中形成的所述脂质体具有小于300nm的平均直径，并且95％的所述粒子具有200
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275nm的直径，并且其中所述方法不需要尺寸排除步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PC与lyso
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PS的比例为85:15至70:30。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述PC以二肉豆蔻酰
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sn
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甘油
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3磷脂酰胆碱(DMPC)存在。4.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞茜，
申请(专利权)人：纽约州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：