一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法技术

本发明专利技术属生化分析领域，涉及一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。本发明专利技术利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离－电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度ｐＨ干胶条等电聚焦结合所述凝胶垂直电泳分离－基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离鉴定大分子量蛋白质。所提供的凝胶孔径大、机械强度大、分辨率高、重现性好、及质谱兼容性好，可同时根据组分的不同比例调整合适的大分子量分离范围。能选择性地分离１００ｋＤａ以上分子量区间的蛋白质，重现性达ＲＳＤ？７．６％，明显提高鉴定率。本方法为分离大分子量蛋白质提供有效工具，可应于蛋白质组学研究领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生化分析领域，涉及。具体 涉及一种利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大分 子量蛋白质的方法。
技术介绍
蛋白质组是研究发现临床重大疾病的生物靶标的一个有力的工具。目前，蛋白质 组研究正日益受到国内外科研工作者的密切关注。时间显示，为了减少实际样品的复杂性， 蛋白质的分离是至关重要的。现有技术公开了大规模的蛋白质分离主要依赖于凝胶电泳 技术和液相色谱技术。前者由于其成熟的技术和良好的分离能力，仍是当今分离复杂蛋白 质样品的首选，并得到生物质谱的技术支持得以大规模分析鉴定。但是低丰度蛋白、极酸极 碱性区蛋白、高分子量蛋白和疏水性蛋白等的分析和鉴定仍是蛋白质组学研究的重点和难 点内容。其中，大分子量蛋白质(分子量大于100kDa)由于其和很多重大疾病相关，如迪谢 纳_贝克肌肉萎縮症、原发性心肌炎等，越来越受到重视。 一般分离采用的聚丙烯酰胺水凝 胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂(过硫酸铵)，四甲基 乙二胺(TEMED)作为加速剂催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺 凝胶形成网状结构，具有浓縮效应、电荷效应、分子筛效应，通过蛋白质的分子量差异对蛋 白进行分离。但是，分离大分子量蛋白所需要的聚丙烯酰胺凝胶单体浓度太低(小于5% w/v)，这样的聚丙烯酰胺凝胶易碎，不易于操作。因此很多学者将另一种水凝胶——琼脂糖 凝胶引入蛋白质分离系统中，以期具有相对大孔径且机械强度较大的琼脂糖凝胶可以实现 大分子蛋白的分离。但是无论是将琼脂糖胶作为等电聚焦介质还是分子筛作用的垂直电泳 介质，都面临了很多问题，包括其凝固点高不利于室温操作和胶的重现性，染色方法与质谱 鉴定不兼容等。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术大分子量蛋白分离分析困难的问题，提供一种分离 富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。本专利技术以水凝胶作为电泳支持介质，尤其是利用低熔 点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大分子量蛋白质。 本专利技术所述的新型凝胶是一种低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合凝胶，其特点在 于既具有琼脂糖凝胶平均孔径大、分辨率高、机械强度好的特点，又具有聚丙烯酰胺凝胶质 谱兼容型的特点，最重要的是采用了低熔点琼脂糖代替普通琼脂糖，熔点和凝固点都大大 低于普通琼脂糖，便于操作和充分混匀，适用于普通薄板垂直电泳，可形成均一的、重现性 好的混合凝胶。 本专利技术中，联和应用新型凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离_电喷雾质谱鉴定 的分析路线(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合新型凝胶垂直电 泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。3 所述MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高 效富集除盐，使得大分子量蛋白质的鉴定率大大提高。。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现 1.采用低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)和聚丙烯酰胺混合凝胶 (AgPAGE)作为电泳支持介质来分离分子量大于100kDa的蛋白质。 2.根据低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺两个组分的不同比例调整合适的大分子量分 离范围。 3.利用与质谱兼容的银染方法进行蛋白质显色且进行胶内酶解提肽。 4.ESI-MS鉴定路线中，先用新型凝胶将大分子量蛋白从其他蛋白中得到初分离，酶解后的肽段再进入LC分离，简化了分离体系。 5.MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高效虽集fe盐o 本专利技术中，通过下述方法制备低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶 低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)溶于含有pH 7 9的缓冲溶液中，在高于熔点的水浴中充分溶解，然后冷却至室温，制成低熔点琼脂糖溶液；另一方面，制备低浓度的丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺交联剂的质量比范围为25 40，然后将以上两种溶液按照丙烯酰胺与低熔点琼脂糖的质量比在35 2的范围内混合，再加入TEMED加速催化剂，倒入垂直电泳玻璃板槽，引发自由基聚合反应，形成均匀的薄板凝胶。 表1为几种典型的低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶的制备步骤。 表lStep One0.8% lmpAga10 mL7% polyacrylamideb20 mLAgarose80 mg30% Stock aerylamide4.67 mL1.5MTris-HC1 8.82.5 mL1.5MTris—HC1 8.85 mL10%SDS0.1 mL腦SDS0.2 mL5% ammonium persulfate0.2H207.4 mLH209.93 mLStep TwoComponentSDS-PAGESDS-lmpAgPAGE 1 SDS-ImpAgPAGE 2SDS-ImpAgPAGE 30.8%LMPA01.5 raL 2 mL3 mL7% polyacrylamide64.5 mL4 mL3TEMED3.6 L3.6L 3.6 L3.6 L 本专利技术中，采用质谱兼容的染色方法，如考马斯亮蓝染色和硝酸银染色法，染色过 程中无需干胶步骤。4 联用新型凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路 线(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合新型凝胶垂直电泳 分离_基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。其中， AgPAGE-LC-ESI-MS/MS路线中，由于LC系统有在线除盐系统，所以凝胶电泳后的蛋白条带 酶解产物可直接在线LC-MS联用；IEF-AgPAGE-MALDI-MS路线中，采用纳米核壳复合材料酶 解的单个蛋白点进行快速、高效富集除盐，实现离线富集除盐，然后进入质谱分析。该纳米 核壳复合材料是一类含有无机纳米内核的聚甲基丙烯酸甲酯(P匿A)微球，直径在100 500纳米范围。将此材料加入多肽或蛋白质样品的溶液富集，富集时间在10-12分钟之间， 富集温度在25-37摄氏度之间，离心去除上清后，可直接与基质均匀混合，形成均匀细致的 结晶，进行基质辅助激光解析离子化质谱分析。 本专利技术使用的混合凝胶结合了两种常用于生物大分子电泳的凝胶的优势低熔点 琼脂糖凝胶平均孔径大，可以使大分子量蛋白质得到有效分离；低熔点琼脂糖相对普通琼 脂糖便于操作和充分混匀的优势，适用于普通薄板垂直电泳，可形成均一的、重现性好的混 合凝胶；聚丙烯酰胺的存在，使得该凝胶适用于与质谱相兼容的染色和酶解提肽方法。该新 型凝胶具有孔径大、机械强度大、分辨率高、重现性好、及质谱兼容性好的特点，同时可以根 据两个组分的不同比例来调整合适的大分子量分离范围，是分离大分子量蛋白质的有效工 具。本专利技术新型凝胶与基于质谱鉴定的两条蛋白质组学技术路线联用方法的建立，为大分 子量蛋白的分离分析提供了新的方法学。本专利技术可以选择性地分离100kDa以上分子量区 间的蛋白质，重现性可达RSD 7.6%，与纳米核壳复合材料富集法联用可使得鉴定率大大提 高。本专利技术可以广泛应用于蛋白质组学研究领域，开拓了大分子量蛋白质的组学研究方法。附图说明 图1为标准分子量标示蛋白的一维薄板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用所述凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离－电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度ｐＨ干胶条等电聚焦结合所述凝胶垂直电泳分离－基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离大分子量蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈雯雯，陆豪杰，杨芃原，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]