一种鸭细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术根据鸭细小病毒VP2基因核苷酸序列，利用昆虫细胞

【技术实现步骤摘要】
一种鸭细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种鸭细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品


技术介绍

[0002]鸭细小病毒病又称鸭短喙
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侏儒综合征、“鸭大舌病”，由鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,DPV)引起。DPV的基因组为单链线状DNA，大小约5000nt，主要编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP)。结构蛋白包括VP1、VP2、VP3，由同一段基因通过可变剪接形成不同的翻译模板所产生，三种蛋白的大小分别为82kDa、65kDa、58kaDa，虽然起始位点不同，但在同一位点终止。其中VP1包含VP2和VP3的全部氨基酸序列，而VP2又包含VP3蛋白的全部氨基酸序列。VP2和VP3是病毒最重要的免疫性蛋白成分。
[0003]该病主要症状为鸭喙畸形、萎缩变短，舌头肿大伸出并垂在喙外，两腿无力、不愿行走，生长发育障碍，翅腿易折、羽毛凌乱。发病率10％～30％，部分鸭群发病率可达50％，但死亡率相对较低。病毒感染雏鸭可造成大量残次鸭，成年鸭虽不表现临床症状，但可将病毒垂直传播给下一代，给水禽养殖业造成极大的安全隐患。
[0004]防控该病的最有效途径是疫苗免疫，但目前市场上的商品化疫苗较少，研制安全、高效的疫苗迫在眉睫。
[0005]杆状病毒表达系统(Baculovirus expression system)又称昆虫细胞表达系统，是以杆状病毒(主要是昆虫核型多角体病毒)作为外源基因载体，昆虫细胞或幼虫作为受体的真核表达系统。是一种安全、高效的新型疫苗载体，广泛用于各种重组蛋白的表达。该表达系统具有如下诸多优点：表达的蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；蛋白翻译后的加工修饰；表达水平高，可达总蛋白量的30％；可容纳大分子的插入片段；能同时表达多个基因。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于根据鸭细小病毒VP2基因核苷酸序列，利用昆虫细胞
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杆状病毒表达系统进行鸭细小病毒VP2蛋白的高效表达，经灭活、纯化后配以适当佐剂制备灭活疫苗，并使用琼脂扩散沉淀试验(琼扩试验)进行疫苗免疫后鸭体内抗体评价，为市场提供安全、高效的新型疫苗与更方便的检测方法，以满足市场对鸭细小疫苗的需求与应用。
[0007]本专利技术的技术方案
[0008]1.本专利技术所述的一种鸭细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒载体灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的主要成分为重组杆状病毒rBac
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HBM
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VP2株高效表达的鸭细小病毒VP2蛋白；
[0009]其所述的重组杆状病毒rBac
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HBM
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VP2株的构建步骤包括：
[0010](1)真核表达载体的选择：选用真核表达载体pFastbac1进行鸭细小病毒VP2蛋白的表达；
cttagtggtg gtggtggtgg tg
‑3’
72(序列4)
[0028](2)构建真核表达载体pFastbac1
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HBM
‑
VP2：将生物公司合成的质粒pUC
‑
HBM
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VP2与真核表达载体pFastbac1同步进行双酶切(BamHI/XhoI)，并对酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的HBM
‑
VP2基因片段和pFastbac 1载体。反应体系如下(表1、表2)。
[0029]表1VP2基因片段酶切反应体系
[0030][0031]表2pFastbac 1载体酶切反应体系
[0032][0033]将完成双酶切的HBM
‑
VP2基因片段和pFastbac 1载体使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜。反应体系如下(表3)。
[0034]表3连接体系
[0035][0036]将10μL连接成功的连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中混匀，42℃水浴热休克90s，再冰浴2min，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1h。取1.0mL菌液浓缩成100μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16h。
[0037]挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2h，以菌液作为模板，VP2
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F和VP2
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R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小。将鉴定正确的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存，获得pFastbac1
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HBM
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VP2真核表达载体，即杆状病毒重组质粒。
[0038](3)制备重组杆粒Bac
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HBM
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VP2：取1μL构建成功的杆状病毒重组质粒pFastbac1
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HBM
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VP2，加入到100μL的DH10Bac感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90s，再冰浴2min，加入900μL不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5h。取100μL菌液稀释81倍后，取100μL稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X
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gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48h后挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X
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gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48h，挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒，PCR鉴定后获得含有重组Bacmid的重组杆粒Bac
‑
HBM
‑
VP2。
[0039](4)重组杆状病毒的转染与纯化：在6孔板中加入生长状态良好的Sf9细胞(约4.0
×
105个细胞/mL)，待细胞贴壁。取40μL Cellfectin Reagent转染试剂加入到Grace
’
s培养
基中，终体积为1mL，混匀作为A液，取10μg重组Bacmid加入到Grace
’
s培养基中，终体积为1mL，混匀作为B液。将A液和B液混合均匀，室温静置15～30min。Sf9细胞贴壁后弃去培养基，补加无血清的Grace
’
s培养基，2.0mL/孔，然后每孔滴加DNA
‑
脂质复合物，200μL/孔，27℃孵育5h，移除转染复合物，细胞培养基洗三次，添加新鲜培养基，2.0ml/孔，27℃培养，当出现细胞病变时，将上层培养基转移到无菌EP管中，收获重组杆状病毒病毒液，置
‑
70℃以下保存。在直径为6cm的细胞培养皿中接种2.0
×
106～2.5
×
106个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释(稀释比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明所述的一种鸭细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒载体灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的主要成分为重组杆状病毒rBac
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HBM
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VP2株高效表达的鸭细小病毒VP2蛋白；其所述的重组杆状病毒rBac
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HBM
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VP2株的构建步骤包括：(1)真核表达载体的选择：选用真核表达载体pFastbac1进行鸭细小病毒VP2蛋白的表达；(2)真核表达载体的构建：将合成的优化序列克隆至pUC19载体，获得质粒(pUC
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VP2)后与真核表达载体pFastbac1同步进行BamHI/XhoI双酶切，连接后转化DH5α感受态细胞，获得真核表达载体pFastbac1
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HBM
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VP2质粒；(3)重组杆粒的制备：将pFastbac1
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HBM
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VP2质粒转化DH10bac菌株，利用Tn7转座子优势，实现目的基因在宿主菌内的大量繁殖；用传统碱裂解法获得重组杆粒(Bac
‑
HBM

【专利技术属性】
技术研发人员：李安，宋丽丽，徐守兴，贾爱琴，王蕾，吴连勇，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
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