一种寨卡病毒的靶点序列及其应用制造技术

本申请是申请号为CN202010726669.4的分案申请。本发明专利技术提供一种寨卡病毒的靶点序列，其为RNA病毒基因序列中含20～40个碱基、且与人类基因组序列相似性不低于95％的核酸序列片段，其包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的靶点序列。本发明专利技术还涉及构建上述靶点序列的引物组合物、与上述靶点序列相关的生物材料以及上述靶点序列的应用。本发明专利技术构建的上述序列的病毒片段具有与人基因组DNA相互作用的功能，其类似病毒miRNA，同时验证了过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，并提出上述靶点片段是RNA病毒的重要致病物质的全新概念。上述靶点序列对RNA病毒的检测及诊断、药物筛选以及开展RNA病毒引发的病症的治疗等均具有重要应用价值。有重要应用价值。有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种寨卡病毒的靶点序列及其应用
[0001]本申请是申请号为CN202010726669.4、申请日为2020年07月25日、专利技术名称为“一种RNA病毒的靶点序列及其应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RNA病毒的靶点序列及其应用，具体为一种寨卡病毒的靶点序列及其应用。

技术介绍

[0003]RNA病毒也称RNA型病毒，是指遗传物质是RNA的病毒。病毒RNA的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低很低，几乎是没有的，所以其变异很快。而疫苗是要根据病毒的固定核苷酸序列或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒疫苗较难开发。它不可单独进行繁殖，必须在活细胞内才可进行。常见的RNA病毒有：艾滋病病毒、脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒(2019
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nCoV)等。冠状病毒是一类带有囊膜的不分节段的正义RNA病毒，能够感染多种哺乳动物和鸟类等宿主，特别是对人类可导致轻度至中度呼吸道疾病。在过去的二十年里，人畜共患传染过程中导致了两种高致病性冠状病毒的出现：严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome，SARS
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CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome，MERS
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CoV)。目前没有特异性针对冠状病毒的有效靶点。
[0004]核酸是生物体内遗传信息储存与传递的一个重要载体，在生物功能的调控上也发挥着极其重要的作用，随着人们对核酸的结构与功能认识的不断深入，核酸作为药物设计靶点的价值越来越被大家所重视。MicroRNA(miRNA)是一类长约22～25个核苷酸的单链短序列小RNA，它不编码蛋白质，但能以其5
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末端第2～8位核苷酸以非完全性碱基配对的方式结合于同源mRNA的3
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UTR(3
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非转译区)，最初人们认为miRNA的发卡结构中只有其中一条链中的序列发挥调控作用，通过诱导信使RNA(mRNA)的降解和转录后基因沉默来负向调节基因的表达发挥功能，而另一条链会降解掉，但后来越来越多的证据发现miRNA的上下链，都会作为独立的miRNA发挥作用。除了miRNA负向调控，有些个案报道在特殊情况下miRNA能够促进基因的表达或翻译(Vasudevan et al.,2007,Vasudevan and Steitz,2007,Place et al.,2008)。XIAOM等人在2015年发现例如has
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miR
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26a
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1、has
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miR
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3179和has
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24
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1等能够与增强子结合，该结果发表在RNABiology杂志上，并在全基因组的水平上激活基因表达(XIAO M,LI J,LI W,et al.2017.MicroRNAs activate gene transcription epigenetically as an enhancer trigger.RNA Biol[J],14:1326
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1334.)。专利技术人前期工作表明，miRNA的这种特性并非是个例，而是适用于很多组织和细胞。在研究miRNA自身的表观遗传学调控机制时，在7种不同的组织细胞中，对1594条miRNA前体进行了系统分析，意外地发现有300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志H3K4mel或H3K27ac高度重叠。这让专利技术人将同时具有组织细胞特异性的miRNA和增强子这两个重要的分子生物学事件联系起来(Xiao et al.,2017)。基于此，专利技术人认为miRNA是重要的双功能
分子。当miRNA位于细胞浆时，它可以作用于mRNA 3
’
UTR区域，如同灭火器一样，阻断mRNA的翻译进而发挥基因的负调控作用；与此相反的是，当它位于细胞核中时，就像一个点火器，通过结合增强子改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达。专利技术人把定位于核内并有激活作用的RNA称为NamiRNA(nuclear activating miRNA)。基于此，专利技术人提出了NamiRNA
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增强子
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靶基因网络激活模型，用于揭示细胞核内miRNA功能。令人惊喜的是，NamiRNA与靶基因存在直接的正向调控关系，它还参与肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭等生物学行为。
[0005]透明质酸(hyaluronic acid，HA)是蛋白多糖中糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)的主要成分之一，也是目前研究较多的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分之一，在正常组织功能和发育中发挥重要作用，包括为细胞提供支持和锚定，促进细胞间信号传导以及促进细胞移动和迁移。HA由一类称为HA合成酶(hyaluronic acid synthase，HAS)的整合膜蛋白合成，其中脊椎动物具有三种类型：HAS1、HAS2和HAS3。这些酶通过将葡萄糖醛酸和N
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乙酰氨基葡糖反复添加到新生多糖中来延长HA，并通过细胞膜挤出和进入细胞外空间。HA是一种大分子黏性糖胺聚糖，可由Ⅱ型肺上皮细胞、内皮细胞及肺成纤维细胞分泌，其中成纤维细胞可受致病因子，如氧自由基等的刺激合成大量HA。HA的基本结构是β
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D葡萄糖酸和2
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乙酰基
‑2‑
去氧
‑
D
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葡萄糖分别以β1.3和β2.4糖苷链连接的重复二糖直链分子聚合体，为最主要的糖胺多糖，HA在肺组织主要分布于毛细血管和细支气管周围的间质中，广泛表达于细胞外基质，也可表达于细胞表面。透明质酸的最大作用就是可以吸收和保存水分，一个透明质酸分子可以吸附9个水分子，透明质酸的增多无疑会加剧局部水分的增多。已有研究表明HA具有增加局部水肿并促进炎症级联反应，导致白细胞迁移、增殖和分化。
[0006]透明质酸合成酶抑制剂(4
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Methylumbelliferone，4
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MU)是HA合成的选择性抑制剂。4
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MU是一种香豆素家族的衍生物。其他香豆素衍生物，例如苯丙香豆素金华法林由于其抗凝机制多以预防性药物来减少心血管疾病的发生。ACE2是新型冠状病毒的受体，其表达量与新型冠状病毒引起的疾病的进程有紧密的相关性。HAS1、HAS2、HAS3是透明质酸合成酶家族，其表达量在细胞外基质中的沉积增加与新型冠状病毒引起的疾病及其并发症有紧密的关系。FBXO15是F
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box蛋白家族的成员，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。MYL9是肌球蛋白轻链9，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。KALRN是RhoGEF激酶，其表达量与结节病的进程和肾脏和肺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA病毒的靶点序列，其特征在于，所述靶点序列为RNA病毒基因序列中包含20～40个碱基、且与人类基因组序列的相似性不小于95％的核酸序列片段；其中，所述RNA病毒包括寨卡病毒，所述寨卡病毒的靶点序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。2.根据权利要求1所述的一种RNA病毒的靶点序列，其特征在于，所述RNA病毒还包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、埃博拉病毒、艾滋病病毒中的至少一种。3.一种用于构建RNA病毒的靶点序列的引物组合物，其特征在于，靶点序列SEQ ID NO.1的引物为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.7；和/或，靶点序列SEQ ID NO.2的引物为SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.11；和/或，靶点序列SEQ ID NO.3的引物为SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15。4.一种与权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料选自下述A)～B)中的一种：A)与权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列互补配对的DNA和/或RNA分子；B)含有权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列或A)中所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系。5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组载体，其构建步骤包括：1)设计引物，PCR扩增所述RNA病毒的靶点序列；2)将扩增的序列片段和表达载体酶切，连接目的序列片段和表达载体；3)将连接产物转化大肠杆菌，培养；4)鉴定后提取重组质粒并包装。其中，所述重组载体上有表达寨卡病毒的靶点序列。6.一种如权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列的应用，其特征在于，所述应用选自以下应用中的至少一种：在细胞水平上激活相关基因的应用、在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用、在筛选或制备用于预防或治疗RNA病毒引发的病症的药物中的应用、在制备RNA病毒检测或诊断试剂中的应用、在制备针对RNA病毒的疫苗中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：于文强，徐建青，汪海林，李伟，连丞，徐鹏，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：