一种QS21免疫佐剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种QS21免疫佐剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)皂素粗品的溶解及过滤，(2)反相粗纯，(3)反相精纯，(4)析出重溶步骤，和(5)超滤置换步骤。使用本发明专利技术技术路线获得的QS21佐剂，纯化收率不低于50％，最终获得的QS21的纯度不低于94％，在刺激免疫功能、毒性以及稳定性等多个方面，都不弱于现有相关产品。产品。产品。

【技术实现步骤摘要】
一种QS21免疫佐剂的制备方法


[0001]本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种QS21免疫佐剂的制备方法。

技术介绍

[0002]2017年美国疾病控制和预防中心(CDC)免疫实践顾问委员会(ACIP)发布意见，推荐葛兰素史克重组亚单位疫苗取代默沙东减毒活疫苗用于50岁及以上老年人群的免疫接种。该疫苗中，使用了皂树皂苷21(QS21)作为免疫佐剂。
[0003]皂树皂苷21(QS21)结构式如下，分子式：C92H148O46，分子量：1990.14，一般性状为无色透明液体。
[0004][0005]在癌症患者群体中，QS
‑
21剂量在100～200μg范围内具有最佳活性和良好耐受性。在这个剂量范围内的毒性是大多数患者注射部位出现2～10厘米的红斑和硬结，以及偶尔出现轻微的低度流感样症状。此时，超过1000名患者接种了含有100μg剂量的QS
‑
21疫苗，没有剂量限制毒性被报道。
[0006]在癌症患者群体中100或150μg的剂量的QS
‑
21耐受性相对较好，并且已被证明比其他免疫佐剂更有效地增强对各种抗原的免疫应答。然而，QS
‑
21剂量与免疫效力的相关性表明，如果高剂量可以安全使用，免疫原性可以进一步提高。对于大多数患者群体而言，QS
‑
21相关的副作用限制剂量约为50μg，癌症除外。
[0007]QS
‑
21浓度低至7～9μg/ml可引起50％引起绵羊红细胞(SRBC)溶血，表明QS
‑
21限制剂量相关的副作用约50μg，癌症患者(如黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌)除外。
[0008]QS
‑
21增强了牛对油佐剂口蹄疫疫苗的早期抗体应答，QS
‑
21剂量750μg/牛。
[0009]使用相对高剂量的ALFQ免疫调节剂的两个动物模型(恒河猴和兔)获得的安全性数据表明使用特定的脂质和胆固醇比例的ALFQ可以减少QS
‑
21介导的细胞溶解和其他毒性不良反应(ALFD包含100μg/ml QS
‑
21)。
[0010]综上，QS
‑
21是一种安全性高，耐受性良好的新型药用佐剂。
[0011]QS
‑
21的主要作用可以概括为：1)通过作用于抗原提呈细胞(APC)和T细胞，在体内刺激Th2体液和Th1细胞介导的免疫应答，导致Th1细胞因子的释放，参与清除细胞内病原
体。2)激活小鼠APC中的NLRP3型炎症小体，随后释放Caspase
‑
1依赖的细胞因子IL
‑
1β和IL
‑
18，它们对Th1型应答起重要作用。3)单磷酰脂A(MPLA)与脂质体(AS01)中的QS
‑
21在早期IFN
‑
γ应答中的独特协同作用机制，促进疫苗免疫原性。
[0012]以QS
‑
21作为佐剂成份的两种疫苗已经上市：1)带状疱疹疫苗(HZ/SU)于2017年获得美国食品和药物管理局的许可，并于2018年在欧盟获得营销授权；2)RTS,S/AS01疟疾疫苗该疫苗于2015年获得欧洲药品管理局批准，可在撒哈拉以南国家进一步实施，供常规使用。
[0013]但是，目前商品化QS
‑
21供应被少数国际厂商垄断，为了确保疫苗规模化生产时，原辅料供应得到保障。
[0014]基于此，提出本专利技术，涉及QS21免疫佐剂的制备方法。

技术实现思路

[0015]本专利技术首先涉及一种以半纯化的商品级或食品添加剂级的半纯化皂素为原料，制备皂树皂苷21(QS21)免疫佐剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0016](1)皂素溶解及过滤，
[0017]以稀释液对皂素原料进行溶解，然后滤器过滤不溶物；
[0018](2)反相粗纯，
[0019]取步骤(1)得到的皂素过滤样品溶液，按照如下步骤进行反相粗纯：
[0020]1)上样：上样于UniPSN 30
‑
300色谱介质；
[0021]2)洗脱：以2.5％B到21.25
±
5.00％B线性梯度洗脱目的峰，并分段收集高纯度的样品，合并粗纯皂素溶液；
[0022](3)反相精纯，
[0023]取步骤(2)得到的粗纯皂素溶液，按照如下步骤进行反相精纯：
[0024]1)上样：用水稀释样品溶液至乙腈浓度为22％～28％，上样于UniPS 10
‑
300色谱介质；
[0025]2)洗脱：10％B到25
±
5％B线性梯度洗脱目的峰，分段收集高纯度样品并合并；
[0026]3)合并后的样品重复上述1)～2)步骤1～3次，优选的，重复2次；
[0027](4)析出重溶步骤，
[0028]1)取步骤(3)制备得到的纯化皂素样本溶液，加入2倍体积的水混匀，室温放置后离心收集沉淀；
[0029]2)向沉淀中加入溶解液，搅拌溶解后，去除有机溶剂样品，优选的，溶解液的加入量与步骤(3)制备得到的纯化皂素样本溶液的量相同；
[0030](5)超滤置换步骤，
[0031]1)取步骤(4)析出重溶后获得的皂素样品溶液，用超滤置换液进行超滤浓缩获得浓缩后的QS21佐剂溶液；优选的，超滤浓缩至原体积的30％～50％；
[0032]上述步骤(1)～(5)中，
[0033]稀释液为含30％乙腈、5mM柠檬酸，pH5.0的水溶液；
[0034]B液为含99％乙腈0.1％TFA的水溶液；
[0035]溶解液为含5mM组氨酸pH6.0的水溶液；
[0036]超滤置换液为含5mM组氨酸pH5.0的水溶液。
[0037]进一步的，所述方法还包括：
[0038](6)分装，对步骤(5)超滤置换后的QS21溶液进行除菌过滤，分装后
‑
70℃以下温度保存。
[0039]进一步的，本专利技术所述的皂素原料中，QS21含量不低于8％；水分不高于10％，灰分不高于3％，重金属含量和农药残留符合中国药典标准，使用本专利技术所述方法纯化QS21的收率不低于50％，最终获得的QS21的纯度，不低于94％。
[0040]更进一步的，
[0041]步骤(1)中，按照1:25(W/V)对皂素原料进行溶解，然后以1.0+0.45μm滤器过滤；
[0042]步骤(2)中，上样载量30～60mg/ml，线性流速90～360cm/h，上样结束后，以A1液冲洗，以2.5％B液冲洗杂质；梯度洗脱时，收集纯度高于30％的样品进行合并；
[0043]步骤(3)中，上样载量10～50mg/ml，线性流速：100～140cm/h；上样结束后以A2液冲洗，以10％B冲洗杂质，第一次反相精本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以半纯化皂素为原料，制备皂树皂苷21(QS21)免疫佐剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)皂素溶解及过滤，以稀释液对皂素原料进行溶解，然后滤器过滤不溶物；(2)反相粗纯，取步骤(1)得到的皂素过滤样品溶液，按照如下步骤进行反相粗纯：1)上样：上样于UniPSN 30
‑
300色谱介质；2)洗脱：以2.5％B到21.25
±
5.00％B线性梯度洗脱目的峰，并分段收集高纯度的样品，合并粗纯皂素溶液；(3)反相精纯，取步骤(2)得到的粗纯皂素溶液，按照如下步骤进行反相精纯：1)上样：用水稀释样品溶液至乙腈浓度为22％～28％，上样于UniPS 10
‑
300色谱介质；2)洗脱：10％B到25
±
5％B线性梯度洗脱目的峰，分段收集高纯度样品并合并；3)合并后的样品重复上述1)～2)步骤1～3次，优选的，重复2次；(4)析出重溶步骤，取步骤(3)制备得到的纯化皂素样本溶液，加入2倍体积的水混匀，室温放置后离心收集沉淀；然后向沉淀中加入溶解液，搅拌溶解后，去除有机溶剂样品，优选的，溶解液的加入量与步骤(3)制备得到的纯化皂素样本溶液的量相同；(5)超滤置换步骤，取步骤(4)析出重溶后获得的皂素样品溶液，用超滤置换液进行超滤浓缩获得浓缩后的QS21佐剂溶液；优选的，超滤浓缩至原体积的30％～50％；其中，稀释液为含30％乙腈、5mM柠檬酸，pH5.0的水溶液；B液为含99％乙腈0.1％TFA的水溶液；溶解液为含5mM组氨酸pH6.0的水溶液；超滤置换液为含5mM组氨酸pH5.0的水溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(6)分装，对步骤(5)超滤置换后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈德祥，谭枫于，胡业勤，龚磊，章伟平，
申请(专利权)人：成都迈科康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：