针对IV型胶原蛋白α3链的抗体制造技术

本文提供了靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段。本文还提供了该抗体或其抗原结合片段在诊断Alport综合征方面的应用。原结合片段在诊断Alport综合征方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
针对IV型胶原蛋白
α
3链的抗体
[0001]本申请要求于2021年12月28日提交至中国专利局、申请号为202111630527.9的中国专利申请的优先权，在此通过引用将其全文并入本文。


[0002]本专利技术属于抗体领域，涉及特异性针对IV型胶原蛋白的单克隆抗体，具体涉及特异性针对其α3链的单克隆抗体。

技术介绍

[0003]Alport综合征(Alport syndrome)亦称遗传性进行性肾炎，临床特点是血尿、蛋白尿及进行性肾功能减退，部分患者可合并感音神经性耳聋、眼部异常、食管平滑肌瘤等肾外表现。该病由编码肾小球基底膜IV型胶原α3～α5链的基因COL4An(n＝3，4，5)基因突变所致。约85％的Alport综合征患者是COL4Α5或COL4Α5和COL4A6两个基因突变导致的X连锁显性遗传型Alport综合征(X
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linked Alport syndrome，XL Alport综合征，OMIM 301050)，其中男性患者病情较重，40岁前肾衰竭的比例达90％，女性患者病情相对较轻。约15％的Alport综合征患者是COL4A3或COL4A4基因突变导致的常染色体遗传型Alport综合征，其中以常染色体隐性遗传型Alport综合征(autosomal recessive Alport syndrome，AR Alport综合征，OMIM 203780)患者为主，几乎均在30岁前出现肾衰竭。
[0004]至今尚无基于人口学的Alport综合征的流行病学资料，但在临床出现血尿的遗传性。肾脏疾病中Alport综合征较常见。如果又有进展至终末期肾病(ESRD)的特点，则Alport综合征最常见。来自美国部分地区的资料显示：Alport综合征基因频率大约为1:5000或1:10000。国外肾活检标本中，Alport综合征占1.6％～4％，中国几组较大宗的肾活检病理研究报告(包括13519例、2315例及1100例)中，也分别有0.729％、1.2％和0.818％的患者被诊断为Alport综合征。不同的资料还显示终末期肾病患者中，Alport综合征占0.2％～5％，占儿童慢性肾功能衰竭患者的1.8％～3％，占各年龄接受肾移植患者的0.6％～2.3％。但是在持续性血尿患者，尤其是儿童患者中，Alport综合征较常见，占11％～27％。迄今，尚未确定Alport综合征的发病率在种族和地域分布上的差异，但美国黑人中相对少见。
[0005]临床症状综合征的诊断，目前主要有以下几种方法：
[0006]一、依据临床综合征表现诊断：典型的Alport综合征临床表现为“血尿+耳聋+肾衰竭家族史”，这种诊断方法应用广泛，被大多数临床大夫掌握，是诊断Alport综合征最简单常用的方法。但是依据临床综合征表现对Alport综合征的诊断并不确切，也不能区分是哪一种遗传型，而且对临床上无耳聋症状的Alport综合征患者容易漏诊。
[0007]依据肾组织电镜诊断：Alport综合征患者肾组织电镜典型的病理改变是肾小球基底膜厚薄不均，致密层撕裂、分层、篮网状、虫蚀状改变。但依据电镜诊断Alport综合征也存在局限性，首先研究发现小年龄的Alport综合征患者肾组织电镜改变不典型，常表现为肾小球基底膜弥漫变薄，容易误诊为薄基底膜肾病。其次即使患者肾组织电镜呈Alport综合征典型改变，也不能区分是哪一种遗传型。
[0008]二、依据基因突变诊断：Alport综合征的X连锁显性遗传型Alport综合征致病基因是COL4A5基因或COL4A5基因和COL4A6基因共同突变；常染色体隐性遗传型Alport综合征是由COL4A3基因或COL4A4基因的纯合突变或复合杂合突变导致；常染色体显性遗传型Alport综合征是由COL4A3基因或COL4A4基因的杂合突变导致。基因突变检测可以确诊Alport综合征，而且在预测疾病进展的风险、产前基因诊断和再生育的遗传咨询以及指导治疗方面有重要作用。但是该方法存在约10％的漏检并且不能判断疾病的进程。
[0009]三、依据肾组织或皮肤组织Ⅳ型胶原α链染色诊断：肾组织或皮肤组织IV型胶原α3链染色方法不仅可以确诊Alport综合征，而且可以诊断常染色体遗传型Alport综合征。常染色体遗传型Alport综合征患者肾组织Ⅳ型胶原α3链染色在肾小球呈阴性，肾小管呈阴性；皮肤基底膜Ⅳ型胶原α3链染色阴性。
[0010]因此，使用IV型胶原α3链抗体检测肾脏及皮肤基底膜中IV型胶原的表达情况是最为理想的Alport综合症诊断方法。
[0011]免疫荧光学检查和免疫组化检测抗原是常见的疾病诊断方法，具有高灵敏度、方便检测的优点，此方法依赖于高特异性抗体识别抗原。因此，有必要研发一种具有高亲和力的抗α3链单抗。

技术实现思路

[0012]在一方面，本文提供了靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括氨基酸序列DSNIH(SEQ ID NO:1)；HCDR2包括氨基酸序列WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2)；HCDR3包括氨基酸序列VNWDYFDY(SEQ ID NO:3)。
[0013]在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包括氨基酸序列RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4)；LCDR2包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:5)；LCDR3包括氨基酸序列SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
[0014]在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体。
[0015]在一些实施方案中，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体。
[0016]在一些实施方案中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0017]在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体或单域抗体。
[0018]在一些实施方案中，所述抗体为鼠抗体或人源化抗体。
[0019]在一些实施方案中，所述抗体的重链包括SEQ ID NO:9所示的信号肽序列，和/或所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:10所示的信号肽序列。
[0020]在一些实施方案中，所述抗体的重链和/或轻链包括纯化标签。
[0021]在一些实施方案中，所述抗原结合片段为Fab、Fab'或F(ab')2。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区的HCDR1包括氨基酸序列DSNIH(SEQ ID NO:1)；HCDR2包括氨基酸序列WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2)；HCDR3包括氨基酸序列VNWDYFDY(SEQ ID NO:3)。2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，还包括轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包括氨基酸序列RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4)；LCDR2包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:5)；LCDR3包括氨基酸序列SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体。4.如权利要求1
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3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体。5.如权利要求1
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4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。6.如权利要求1
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5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体、单链抗体或单域抗体。7.如权利要求1
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6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为鼠抗体或人源化抗体。8.如权利要求1
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7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链包括SEQ ID NO:9所示的信号肽序列，和/或所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:10所示的信号肽序列；或者所述抗体的重链和/或轻链包括纯化标签。9.如权利要求1
‑
8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab、Fab'或F(ab')2。10.如权利要求1
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9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，还包括Fc片段。11.如权利要求1
‑
10任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其通过ELISA测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的EC
50
值为约4.644ng/ml；或者其通过生物膜层干涉(BLI)技术测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的KD值小于0.4nM，优选为约3.987
×...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦磊，刘培，田入勇，史敏龙，钱永洪，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：