碱性pH下的蛋白质纯化方法技术

本公开描述了用于从包括细胞壁的细胞中纯化胞质蛋白的方法，所述方法涉及在8.5至12.0的范围内的碱性pH下的处理。对细胞进行穿孔而不是裂解，由此允许与细胞壁碎片良好分离。穿孔可以涉及碱性耗竭处理、加热至约6℃、使用还原剂、机械处理和其组合。所述方法进一步产生具有最小化的不令人期望的气味和风味的蛋白质产品。的蛋白质产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】碱性pH下的蛋白质纯化方法


[0001]本专利技术涉及用于纯化蛋白质的方法，并且更具体地涉及用于纯化蛋白质的使经纯化的蛋白质中的不令人期望的气味和风味的产生最小化、增强功能性并且增加蛋白质产率的方法。本专利技术还涉及包含经纯化的蛋白质的食物产品。
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技术介绍

[0004]模仿动物源性食物产品(例如，奶酪或肉)的食物产品的成功可能取决于产生功能性蛋白质，所述功能性蛋白质可以被操纵并且具有低风味，因此蛋白质的来源不容易识别并且不向食物产品提供不可接受的“异味”。常见的蛋白质纯化方法通常包含使用不是食品安全的和/或产生变性蛋白质的化学品的步骤。有用的是具有一种进行蛋白质纯化的方法，所述方法是食物安全的并且在经纯化的蛋白质中产生最少的不令人期望的气味和风味。

技术实现思路

[0005]本文档提供了蛋白质组合物，并且还提供了在整个过程中使用至少约8.5的pH用于从包含真核生物、真菌、原核生物和古细菌细胞在内的微生物细胞纯化蛋白质的方法，所述方法产生了蛋白质组合物。本文档还提供了包含这些蛋白质组合物的食物产品。在一些实施例中，本文所描述的方法是食品安全的、廉价的且可扩展的，同时使经纯化的蛋白质中的不令人期望的气味和风味的产生最小化并且增加蛋白质产率。在本文提供的纯化蛋白质的方法的一些实施例中，其中在纯化过程期间pH小于8.5(例如，8.0或更小)，与在纯化工艺中的一些或全部纯化工艺期间pH大于8.5(例如，9.0或更大)的纯化蛋白质的其它对应方法相比，在所得蛋白质组合物中可能存在增加的异味和/或变味，并且过程产率可能降低。在一些实施例中，本文所描述的组合物可以是食品安全且廉价的，具有最小的不令人期望的气味和风味。可以使用本文所描述的方法纯化总细胞蛋白，例如，从整个细胞中分离或由其产生的蛋白质，包含来自细胞质和细胞核和亚细胞区室(例如，溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、内质网、高尔基体、周质、分泌囊泡、细胞外基质、生物膜、叶绿体和细胞核)的蛋白质(如果适用的话)。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物可以包括总细胞蛋白，但术语“总”不指示蛋白质组合物中存在每种细胞蛋白。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物可以基本上由总细胞蛋白组成。
[0006]此外，蛋白质组合物中的蛋白质可以是功能性的。如本文所述，功能性蛋白质可以具有以下性质中的一种或多种：非变性；能够在加热时形成凝胶(例如，在约7.0的pH下约25mg/mL至约250mg/mL(例如，约25mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约25mg/mL至约150mg/mL、约25mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约250mg/mL、约100mg/mL至约250mg/
mL、约150mg/mL至约250mg/mL或约200mg/mL至约250mg/mL)的悬浮液在加热至约65℃时热转变成凝胶)；在约50℃与约85℃之间的温育期间的热变性，其中在约85℃下经过约20分钟之后，大于约80％的蛋白质变性，如通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)测量的；在处于或高于约50mg/mL(5％w/v)的经纯化的蛋白质的溶液或悬浮液中，当在处于或高于约85℃下加热约20分钟时，蛋白质形成独立式凝胶(具有例如，100Pa储能模量)；可以在约pH 5.5与约pH 10.0之间变性和胶凝；当基于非蛋白溶质的浓度计算离子强度(I)时，可以在I低于约0.5M的溶液中变性和胶凝；在约10mg/mL的蛋白质浓度下，粒径分布D10、D50和D90分别小于约0.1μm、1.0μm和5μm；具有酶活性；在约4.0至约8.0的pH范围内乳液活性指数(EAI)大于或等于约50m2/g蛋白质。
[0007]在一些实施例中，(w/v)悬浮液可以指每100mL溶液中干固体的量(以克为单位)。
[0008]可以存在于蛋白质组合物中的功能性蛋白质的非限制性实例包含具有酶活性的蛋白质，如但不限于半胱氨酸合酶(Met17p，ED 2.5.1.47)、胱硫醚β
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合酶(Cys4p，EC4.2.1.22)、己糖激酶、葡萄糖氧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和脂肪酶。
[0009]酶活性还可以更一般地描述，并且实例可以包含例如氨基酸分解代谢(例如，当没有添加L
‑
半胱氨酸(例如，L
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半胱氨酸本身，或以异构体混合物的形式提供)时(例如，添加到pH为7.0的5mL 2％(w/v)悬浮液中)，硫化氢(H2S)在顶部空间中以小于约0.1ppm存在，并且在(例如，在25℃下经过约24小时之后)将L
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半胱氨酸添加至25mM最终浓度(例如，添加至5mL 2％(w/v)悬浮液中)之后，H2S以大于或等于约0.2ppm(例如，大于或等于约0.3ppm)存在)、葡萄糖分解代谢(例如，从葡萄糖产生丙酮酸盐、产生葡萄糖
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磷酸盐、产生乳酸盐、产生D
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葡萄糖酸
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δ
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内酯)、脂质分解代谢(例如，脂质水解)、还原谷胱甘肽二硫化物和分解过氧化氢。例如，可以使用单酶反应(例如，通过己糖激酶从葡萄糖产生葡萄糖
‑6‑
磷酸盐)或多酶反应(例如，通过多于一种酶将起始材料转化为最终产物(例如，通过糖酵解的酶从葡萄糖产生丙酮酸盐或通过细胞谷胱甘肽生物合成途径从谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸产生谷胱甘肽))来说明酶活性。
[0010]蛋白质组合物可以具有食物活性。如本文所述，具有食物活性的蛋白质可以具有以下性质(基于每克定义)中的一种或多种：能够形成凝胶；能够乳化油和水(水包油、油包水)；能够乳化空气和水(水包空气)。
[0011]在说明书和附图中，使用了以下缩写：CS(细胞悬浮液)；RN(细胞洗涤)；LY(裂解物，例如，通过珠粒研磨、均质器、高剪切混合器或微流化器获得)；CN(离心分离液，例如，进行离心旋转以去除固体的上清液)；MF(微滤，例如，使用直径为0.2μm、0.3μm或0.45μm的孔径)；DF(渗滤，例如，使用pH 9.3+/
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0.3的水)；UF(超滤，例如，使用5kDa、10kDa、30kDa或50kDa的截留分子量)；PZ(巴氏杀菌，例如，在65℃下持续60秒)；SD(喷雾干燥，例如，入口温度为180℃，出口温度为80℃并且进料为0.27LPM)。
[0012]术语“约”是相对于特定值使用的，以解释在测量值时的实验变化。
[0013]在一方面，本文档包含一种用于从细胞(例如，多个细胞)纯化蛋白质的方法，所述方法包含裂解所述多个细胞的水性悬浮液以获得细胞裂解物；任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，澄清所述细胞裂解物以获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。2.一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。3.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的DH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。4.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。5.一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。6.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述可溶性蛋白是含血红素的蛋白。8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述可溶性蛋白具有熔点，并且方法进一步包括：在a)之前，将所述多个细胞加热至比所述可溶性蛋白的所述熔点低约10℃或约5℃的温度。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约30干重％。10.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。11.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。12.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。13.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。14.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。15.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。16.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：在加热所述多个细胞与对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分之间，用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0。17.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约5分钟。18.根据权利要求1、3、4或6中任一项所述的方法，其中穿孔包括用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。19.根据权利要求18所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约10mM至约500mM
还原当量的所述还原剂进行处理。20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述还原剂是食品安全还原剂。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法使所述多个细胞中的至少约25重量％的细胞保持完整。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法不包括对所述多个细胞的机械裂解。25.根据权利要求24所述的方法，其中与包括机械裂解的类似方法相比，所述蛋白质组合物包括更高比例的胞质蛋白。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中进行所述过滤，直到将所述蛋白质组合物的2％(w/v)悬浮液的pH从pH 3调节至pH 12所需的氢氧化钠的量小于或等于3mmol。27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中在未将L
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半胱氨酸添加到...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：非凡食品有限公司，
类型：发明
国别省市：