基于牛全基因组CRISPR-Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法技术

本发明专利技术提供了基于牛全基因组CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于牛全基因组CRISPR
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Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法


[0001]本专利技术属于文库构建
，具体涉及基于牛全基因组CRISPR
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Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法。

技术介绍

[0002]传统的奶牛育种目标集中于提高牛奶或蛋白质产量，但同时忽视了功能性状与健康相关性状。作为一种拮抗作用，长期选择提高生产力与生理和免疫失衡有关，尤其是在哺乳期早期，奶牛经历代谢失衡与免疫失调最为明显，从而对环境影响的易感性增加，影响奶牛健康状态，继发疾病成高发态势。
[0003]产奶量和动物健康受许多因素的影响并与之相关，如遗传、环境压力、饮食、代谢和免疫，这些因素都相互作用。长期以来，人工选择高泌乳量和对乳质提升的角度筛选优质奶牛群体，这也与奶牛应激抵抗能力下降有关。
[0004]奶牛酮病(Ketosis)是围产期奶牛常见的代谢性疾病。围产期奶牛由于受孕晚期激素变化、胎儿迅速增长、分娩、泌乳等高耗能生理应激，同时食欲下降、营养摄入不足，能量“入不敷出”而导致能量负平衡，严重的能量负平衡将导致血酮升高，演变为亚临床酮病或临床酮病。酮病会显著降低奶牛泌乳量和乳质，降低繁殖效率，也会增加皱胃移位、跛行和子宫炎的风险，场造成较为严重的经济损失。β
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羟丁酸(β
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hydroxybutyrate，BHBA)是酮体的重要组成分子，能量限制、生酮饮食、能量负平衡均能够促使机体脂肪动员、脂解，通过肝脏生酮作用(ketogenesis)最终产生BHBA。
[0005]近年来的研究表明BHBA不仅是一种能量物质，而且在细胞表面和细胞内具有其受体分子，介导多种信号传导功能，可以影响基因表达、脂质代谢、神经元功能，还能够调控炎症反应，例如激活羟基羧酸受体2(Hydroxy
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carboxylic acid receptor 2，HCA2)和NLRP3炎症小体，从而阻断炎症中间体的合成。此外，组蛋白赖氨酸β
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羟基丁基化修饰是一种新发现的表观遗传修饰形式，BHBA介导的表观遗传修饰参与重要的细胞生理和代谢调节。因此筛选与BHBA作用相关的基因对于未来解析奶牛酮病发病机制、筛选和鉴定主要的分子标记、筛选药物作用靶点等研究奠定基础。
[0006]随着测序技术和生物信息学的飞速发展，对代谢、免疫相关机制的研究已经由单个基因或通路研究发展为高通量、互作网络式研究。近年来，随着全基因组CRISPR
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Cas9基因编辑技术的发展，对于高通量基因筛选和功能研究“如虎添翼”。
[0007]CRISPR
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Cas9技术已经彻底改变了遗传学传统研究方法，并为人类基因组的编辑提供了一种简单而廉价的方法，例如产生突变导致基因敲除表型。当Cas9靶向与引导sgRNA和原间隔邻近基序NGG具有相同序列的位点时，Cas9酶切双链DNA使之断裂，修复后通常会导致插入或缺失，从而有效地导致基因敲除。混合sgRNA库利用CRISPR
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Cas9基因编辑技术的能力，并将其应用于基因组水平。目前已开发针对人类蛋白质编码基因的全基因组gRNA文库，允许同时产生几乎每个人类蛋白质编码基因的敲除。编辑后的细胞群可以暴露在不
同的条件下，通过提取基因组DNA，生成测序库，并通过下一代测序测量sgRNA的丰度，可以测量sgRNA随时间的消耗或富集。重要的是，CRISPR基因敲除筛选在敏感性和特异性方面都优于shRNA筛选。CRISPR基因敲除文库可用于识别敲除引起细胞适应性缺陷、改变药物敏感性(增敏剂或耐药基因)、调控报告基因或蛋白表达、或特定通路的某种细胞状态或功能所需的基因。
[0008]全基因组CRISPR
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Cas9基因敲除技术已经应用于畜牧业相关研究中。目前我国学者们已经成功构建猪、鸡、家蚕CRISPR
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Cas9全基因敲除文库，在世界范围内也均属首次。基于该技术已经筛选出猪流感病毒、日本乙型脑炎病毒、新城疫病毒、结核分枝杆菌、家蚕抗氟/镉污染物等相关抗性基因。目前对于牛CRISPR
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Cas9全基因敲除文库尚无相关报导。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供了基于牛全基因组CRISPR
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Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法，构建牛全基因组CRISPR
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Cas9文库以及MDBK敲除细胞库，并首次用于酮体作用和病毒感染相关基因筛选，为反刍动物相关研究构建新的研究平台。
[0010]本专利技术提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR
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Cas9文库的构建方法，包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA，以所述sgRNA为模板，利用合成的全基因CRISPR
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Cas9 sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增，回收扩增产物，得文库扩增产物；
[0011]利用线性化的CRISPR
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Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接，连接后转化Trans1
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T1感受态细胞，提取质粒得牛全基因组CRISPR
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Cas9 sgRNA文库。
[0012]优选的，除看家基因和生存必须基因外，针对全基因组的其余基因，每基因设计4条sgRNA。
[0013]优选的，所述线性化的CRISPR
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Cas9文库载体包括利用XhoI酶酶切Lenti
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CRISPR.v2 vector。
[0014]本专利技术还提供了一种慢病毒包装的牛全基因组CRISPR
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Cas9 sgRNA文库，所述牛全基因组CRISPR
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Cas9 sgRNA文库由上述构建方法构建得到。
[0015]本专利技术还提供了MDBK全基因组CRISPR
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Cas9敲除细胞库的构建方法，包括以下步骤：(1)将MDBK细胞培养至汇合为50％～60％，与经含有DMEM高糖培养基稀释的上述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR
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Cas9 sgRNA文库和聚凝胺(polybrene)混合，培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养；
[0016](2)病毒库感染细胞3d后，更换Puro培养基筛选培养至7d后，得MDBK全基因组CRISPR
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Cas9敲除细胞库；所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完全培养基。
[0017]优选的，步骤(1)所述polybrene的终浓度为8μg/mL。
[0018]优选的，所述Puro培养基中嘌呤霉素的终浓度为1μg/mL。
[0019]本专利技术还提供了上述构建方法构建得到的MDBK全基因组CRISPR
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Cas9敲除细胞库
[0020]本专利技术提供了上述构建方法构建得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛全基因组编码基因CRISPR
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Cas9文库的构建方法，其特征在于，包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA，以所述sgRNA为模板，利用合成的全基因CRISPR
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Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增，回收扩增产物，得文库扩增产物；利用线性化的CRISPR
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Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接，连接后转化Trans1
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T1感受态细胞，提取质粒得牛全基因组CRISPR
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Cas9sgRNA文库。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，除看家基因和生存必须基因外，针对全基因组的其余基因，每基因设计4条sgRNA。3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述线性化的CRISPR
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Cas9文库载体包括利用XhoI酶酶切Lenti
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CRISPR.v2vector。4.一种慢病毒包装的牛全基因组CRISPR
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Cas9sgRNA文库，其特征在于，所述牛全基因组CRISPR
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Cas9sgRNA文库由权利要求1～3任一项所述构建方法构建得到。5.MDBK全基因组CRISPR
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Cas9敲除细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将MDBK细胞培养至汇合为50％
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60％，与经含有DMEM高糖培养基稀释的权利要求4所述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR
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Cas9sgRNA文库和聚凝胺混合，培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养；(2)病毒库感染细胞3d后，更换Puro培养基筛选培养至7d后，获得MDBK全基因组CRISPR
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Cas9敲除细胞库；所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文广，石彩霞，刘斌，戴伶俐，刘在霞，郭丽丽，鲍艳春，
申请(专利权)人：内蒙古犇牛科技有限公司，
类型：发明
国别省市：