本发明专利技术公开了ｍｉＲ－１８２作为胶质瘤发生分子标志物的应用及其检测试剂盒，在提出ｍｉＲ－１８２可以作为神经胶质瘤早期诊断的分子标志物的基础上，本发明专利技术制备出检测试剂盒，并提出检测外周血ｍｉＲ－１８２的方法：１）收集待测个体外周血样本，抽提总ＲＮＡ；２）以总ＲＮＡ为模板将ｍｉＲ－１８２特异性逆转录为ｃＤＮＡ；３）用ｍｉＲ－１８２特异性引物进行实时定量ＰＣＲ扩增，获得相对定量ΔＣＴ值，当ΔＣＴ≤７．６１时提示ｍｉＲ－１８２表达阳性。本发明专利技术的方法及试剂盒可以检测各种人群外周血中ｍｉＲ－１８２的表达状况，从而预测胶质瘤的患病风险，用于胶质瘤高危人群的筛查，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤发生分子标志物，具体涉及微小RNA(miRNA)作为分子标志物在 胶质瘤诊断中的应用。
技术介绍
胶质瘤包括各种神经上皮来源的肿瘤，是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿 瘤，约占全部颅内肿瘤的40% 50%。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边 界不清，即使是最现代的神经外科技术也难以做到病理学上的全切除，因而胶质瘤术后复 发率非常高，且随着手术和复发次数的增加，其恶性程度有增加的趋势。运用现代显微外科 技术、放疗、化疗等综合治疗措施后，胶质瘤患者预后仍不理想，高度恶性的多形性胶质母 细胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率仅为58%和31%。胶质瘤的诊断仍然处于以临床、病 理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为晚期，远远不能适应 对胶质瘤进行高危人群筛查和早期诊断的需求。因此，寻找无创伤性的胶质瘤早期诊断标 志物对高危人群进行筛查，以便对脑瘤患者进行早期诊断、早期治疗。 microRNA(miRNA)为长度约21-25个核苷酸的非编码RNA，miRNA能够识别特定的 目标mRNA并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因 表达的作用，目前miRNA在胶质瘤中的研究仍处于起步阶段，但胶质瘤中特异miRNA表达谱 的确定，为神经胶质瘤的诊断与治疗提供了新的方向，最早的相关研究是由Ciafre等人采 用microarray chip技术，在9对临床肿瘤样品(癌及癌旁组织)以及10种恶性胶质瘤细胞 系(以正常的成人及胚胎脑样品为对照)中，对245种miRNA进行了检测，芯片结果分析显 示，miR-221、miR-21等9种miRNAs在恶性胶质瘤中的表达显著上调，其中miR-221上调程 度最高，而miR-128， miR-181a， miR-181b及miR-181c等在脑组织中含量丰富的miRNAs则 表达下调，这些表达水平改变的miRNAs可能与恶性胶质瘤发生发展密切相关。此外，最新 的研究发现，来源于各种组织或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周血中，在血清和 血浆中存在等量的miRNA，并且这些miRNA十分稳定，不容易被血液内源性和外源性RNases 降解，这种稳定存在的特性，足以显示出miRNA在探寻肿瘤早期诊断分子标志物方面的巨 大潜力。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出miR-182 (miRBase登录号MI0000272)能作为胶质瘤的发生 风险的分子标志物之一应用于医药领域，从而提供一种性价比高、易于推广应用的胶质瘤 外周血诊断试剂盒。 在前期的研究工作中，专利技术人发现miR-182在不同级别的胶质瘤组织中存在明显 的差异，且随着胶质瘤的病理级别增加，miR-182的表达明显升高。通过进一步研究证实 miR-182是一个与胶质瘤发生发展密切相关的瘤基因，在各种胶质瘤组织中表达明显上调，而在其它脑瘤组织(包括脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤、髓母细胞瘤等)变化不明 显，这提示miR-182可以作为胶质瘤的特异性诊断标志物。研究还发现，miR-182在肿瘤发 病的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而稳 定存在。因此，专利技术人提出外周血miR-182可以作为胶质瘤早期诊断的分子标志物，制备胶 质瘤外周血诊断试剂盒。 本专利技术的检测外周血miR-182方法1)收集待测个体外周血样本，抽提总RNA ;2) 以总RNA为模板将miR-182特异性逆转录为cDNA ;3)用miR-182特异性引物进行实时定量 PCR扩增，获得相对定量ACT值，ACT值二miR-182于内参基因平均CT值的差值，进行判 断，当A CT《7. 61时提示miR-182表达阳性。 本专利技术的检测试剂盒包括1)从外周血中抽提总RNA所用试剂，包括EDTA抗凝 管、淋巴细胞分离液、Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；2)以总RNA为模板将miR-182 特异性逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA 酶抑制剂、逆转录酶以及miR-182特异性逆转录引物；3)将cDNA实时定量PCR所用试 剂，包括缓冲液、miR-182实时定量PCR特异性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和双蒸 水；所述miR-182的特异性引物为hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ; hsa-miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所述U6snRNA特异性PCR引物其正向弓| 物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。 本专利技术的方法及试剂盒可以检测各种人群外周血中miR-182的表达状况，从而预 测胶质瘤的患病风险，用于胶质瘤高危人群的筛查，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无 创性诊断。此外，由于miR-182的表达随着胶质瘤病理级别的进展而增加，因此，外周血 miR-182的表达量的检测也可以作为胶质瘤患者预后判断的重要指标。附图说明 图1原位杂交检测miR-182在正常脑组织和不同病理级别的胶质瘤组织中的表达 的组织切片图； 图2实时定量PCR方法检测miR-182在正常脑组织和脑瘤组织中的表达结果图； 图3实时定量PCR方法检测miR-182在正常人和脑瘤患者外周血中的表达结果 图。具体实施例方式在前期研究工作中，专利技术人利用miRNA芯片和SAM软件分析筛查10例正常脑组织 和10例胶质瘤组织中差异表达的miRNA时，发现miR-182在正常脑组织和胶质瘤组织中存 在明显差异。 通过进一步miR-182探针原位杂交检测研究，专利技术人发现miR_182在不同级别 的胶质瘤组织中存在明显的差异，且随着胶质瘤的病理级别增加，miR-182的表达明显升 高(参见附图l)，图1中A、B、C、D、E分别为正常脑组织和胶质瘤1、n、III、IV级病理组 织原位杂交检测miR-182探针表达的组织切片图。miR-182探针原位杂交检测结果显示 细胞膜或胞浆呈棕黄色颗粒为miR-182阳性，阴性则细胞膜和胞浆均无棕黄色颗粒。其阳 性表达程度采用PIPS-2020高清晰度彩色病理图文分析系统进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(X400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度值作为该例的测 量值。该实验结果显示1、 II、 III、 IV级胶质瘤的miR-182表达的平均光密度值分别为 0. 24±0. 03、0. 38±0. 06、0. 56±0. 04和0. 65±0. 05，随着病理级别升高而增加，与正常脑 组织(0. 09 ±0. 01)比差异均有显著性(P < 0. 05)。 同时miR-182是一个与胶质瘤发生发展密切相关的瘤基因，在各种胶质瘤组织中 表达明显上调(参见附图2)，而在其它脑瘤组织(包括脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、垂体腺 瘤、髓母细胞瘤等)表达变化不明显，这提示miR-182可以作为胶质瘤的特异性分子诊断标 志物。 研究还发现，miRNA在肿瘤发病的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至微血管 的本文档来自技高网...
【技术保护点】
ｍｉＲ－１８２作为神经胶质瘤发生风险的分子标志物的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，武明花，唐海林，王泽友，廖前进，刘晓萍，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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