本发明专利技术公开了一种融合酶，其序列如SEQ ID No.9所示，还公共了一种毕赤酵母，其细胞表面表达如SEQ ID No.9所示的蛋白。还公开了其在催化降解半乳甘露聚糖中的应用，及其制备方法。本发明专利技术将三个酶融合而成的超大多功能融合酶展示在毕赤酵母表面，与分3次发酵产3种酶后共同催化降解半乳甘露聚糖相比，采用该毕赤酵母全细胞催化降解半乳甘露聚糖可以有效提高半乳甘露聚糖的降解效率。因此，本发明专利技术的表面展示三个酶融合而成的超大多功能融合酶的毕赤酵母可用于提高半乳甘露聚糖的降解效率。赤酵母可用于提高半乳甘露聚糖的降解效率。赤酵母可用于提高半乳甘露聚糖的降解效率。
【技术实现步骤摘要】
融合酶、毕赤酵母、其制备方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种融合酶、表面表达融合酶的毕赤酵母、其制备方法及其在提高半乳甘露聚糖降解效率中的应用，属于合成生物学领域。
技术介绍
[0002]现有技术通过单一的表达α半乳糖苷酶或β甘露聚糖酶，将酶分离纯化固定后用于催化降解半乳甘露聚糖，或者使用3次发酵技术分别表达α半乳糖苷酶1(AGA1)、β甘露聚糖酶1(MAN1)和β甘露聚糖酶2(MAN2)，然后将α半乳糖苷酶1(AGA1)、β甘露聚糖酶1(MAN1)和β甘露聚糖酶2(MAN2)分别分离纯化固定后共同催化降解半乳甘露聚糖。由于半乳甘露聚糖的分子结构比较复杂，既有直链又有侧链，α半乳糖苷酶只能降解侧链，β甘露聚糖酶只能降解直链。单一的表达α半乳糖苷酶或β甘露聚糖酶，只能部分降解半乳甘露聚糖，达不到彻底降解半乳甘露聚糖的目的。在使用3次发酵技术分别表达α半乳糖苷酶1(AGA1)、β甘露聚糖酶1(MAN1)和β甘露聚糖酶2(MAN2)，然后将α半乳糖苷酶1(AGA1)、β甘露聚糖酶1(MAN1)和β甘露聚糖酶2(MAN2)分别分离纯化固定后共同催化降解半乳甘露聚糖时，发酵次数多，分离纯化固定步骤繁琐，酶也不能重复利用，使得发酵的效率低成本高。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供一种融合酶，为α半乳糖苷酶1
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β甘露聚糖酶1
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β甘露聚糖酶2融合蛋白，具有较高的催化降解半乳甘露聚糖的效率。
[0004]本专利技术采取的技术方案为：
[0005]一种融合酶，其序列如SEQ ID No.9所示。
[0006]本专利技术还公开了一种毕赤酵母，在其细胞表面表达如SEQ ID No.9所示的蛋白。
[0007]本专利技术还公开了上述的毕赤酵母在催化降解半乳甘露聚糖中的应用。
[0008]优选的，其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入半乳甘露聚糖水溶液中进行反应。
[0009]本专利技术还公开了上述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：
[0010](1)化学合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc
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L
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aga1
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L
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man1
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L
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man2，其中融合基因序列包含毕赤酵母锚定蛋白基因序列、α半乳糖苷酶1、β甘露聚糖酶1和β甘露聚糖酶2基因序列，毕赤酵母锚定蛋白基因序列、α半乳糖苷酶1、β甘露聚糖酶1和β甘露聚糖酶2基因序列四者以融合基因形式连接，毕赤酵母锚定蛋白基因序列与α半乳糖苷酶1基因序列之间有连接肽序列，α半乳糖苷酶1基因序列与β甘露聚糖酶1基因序列之间有连接肽序列，β甘露聚糖酶1基因序列与β甘露聚糖酶2基因序列之间有连接肽序列，融合基因序列两端包含EcoRI和Not1的酶切位点序列，以及载体pPIC9K的同源臂序列；
[0011](2)将步骤(1)合成的融合基因片段和载体pPIC9K分别经EcoRI和Not1双酶切；
[0012](3)将酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体连接，使融合基因构建到载体pPIC9K中；
[0013](4)将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；
[0014](5)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克隆，从中抽提出质粒pPIC9K
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anc
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L
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aga1
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L
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man1
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L
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man2；
[0015](6)将质粒pPIC9K
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anc
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L
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aga1
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L
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man1
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L
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man2线性化；
[0016](7)将线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选出阳性克隆，得到表面表达AGA1
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MAN1
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MAN2的毕赤酵母。
[0017]优选的，步骤(3)中采用T4 DNA连接酶连接酶切后的融合基因片段与酶切后的pPIC9K载体。
[0018]优选的，步骤(6)中将质粒用SacI酶切线性化。
[0019]本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术将α半乳糖苷酶1
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β甘露聚糖酶1
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β甘露聚糖酶2融合酶展示在毕赤酵母表面，采用该毕赤酵母全细胞催化降解半乳甘露聚糖，可以有效提高半乳甘露聚糖的降解率。且本专利技术还发现，表面展示α半乳糖苷酶1
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β甘露聚糖酶1
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β甘露聚糖酶2融合酶的毕赤酵母比表面展示α半乳糖苷酶1
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β甘露聚糖酶1融合酶或β甘露聚糖酶1
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β甘露聚糖酶2
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α半乳糖苷酶1融合酶的毕赤酵母在催化降解半乳甘露聚糖时酶活更高，半乳甘露聚糖的降解率更高。因此，本专利技术的毕赤酵母可用于提高半乳甘露聚糖的降解率。
附图说明
[0021]图1为本专利技术与现有技术相比的流程对照图。
[0022]图2为本专利技术与现有技术相比的半乳甘露聚糖降解率对照图。图中标记：A：实施例1中使用本专利技术表面展示AGA1
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MAN1
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MAN2三融合酶的毕赤酵母全细胞催化降解半乳甘露聚糖，降解率达到95％以上；B：使用对比例1的表面展示AGA1
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MAN1二融合酶毕赤酵母全细胞催化降解半乳甘露聚糖，降解率约为70％。
具体实施方式
[0023]为更进一步阐述本专利技术为实现预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本专利技术的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。附图1可以展示本专利技术与现有技术相比的流程对照。
[0024]实施例1将融合α半乳糖苷酶1
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β甘露聚糖酶1
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β甘露聚糖酶2展示在毕赤酵母细胞表面的方法及其在全细胞直接催化提高半乳甘露聚糖降解率中的应用，包括如下步骤：
[0025](1)优化毕赤酵母锚定蛋白基因、α半乳糖苷酶1、β甘露聚糖酶1、β甘露聚糖酶2和连接肽的序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；
[0026](2)化学合成如SEQ ID No.6所示的锚定蛋白
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连接肽
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α半乳糖苷酶1
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连接肽
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β甘露聚糖酶1
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连接肽
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β甘露聚糖酶2融合基因(anc
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L
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aga1
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L
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man1
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L
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种融合酶，其特征在于其序列如SEQ ID No.9所示。2.一种毕赤酵母，其特征在于其细胞表面表达如SEQ ID No.9所示的蛋白，该蛋白为AGA1、MAN1和MAN2的融合蛋白。3.权利要求2所述的毕赤酵母在催化降解半乳甘露聚糖中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于其步骤包括：收集培养的毕赤酵母全细胞，将毕赤酵母全细胞加入半乳甘露聚糖水溶液中进行反应。5.权利要求2所述的毕赤酵母的制备方法，其特征在于其步骤包括：(1)合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc
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L
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aga1
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L
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man1
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L
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man2，其中anc为锚定基因，L为连接肽序列，aga1为α半乳糖苷酶1基因，man1为β甘露聚糖酶1基因，man2为β甘露聚糖酶2基因；(2)将步骤(1)合成的融合基因片段构建到载体pPIC9K中；(3)将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆；(4)培养大肠杆菌感受态细胞阳性克...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，张慧，陈海鸣，马赛飞，
申请(专利权)人：上海国龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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