一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法技术方案

本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法。利用乳头瘤病毒样颗粒中主要衣壳蛋白L1蛋白的自组装特性，向使用DTT和EDTA解离的乳头瘤病毒样颗粒中加入mRNA，然后加入终止缓冲液后使L1蛋白重新组装聚合成内部包括有mRNA的乳头瘤病毒样颗粒，该mRNA递药系统可在体内稳定运输，使得mRNA完整进入细胞内表达相应蛋白质，不仅具有良好的生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性，而且可通过口服方式作用，目的蛋白的表达量高。目的蛋白的表达量高。目的蛋白的表达量高。

【技术实现步骤摘要】
一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法


[0001]本申请涉及生物医药
，具体是一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法。

技术介绍

[0002]mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，大小为300~5000kDa，长度为1~15kb。与DNA相比，mRNA不进入细胞核，在细胞质中即可完成蛋白质的合成并发挥功能活性，而DNA需要先进入细胞核，然后转录成mRNA，使DNA的效率低于mRNA。另外mRNA不会插入基因组，而只是瞬时表达编码蛋白，从而降低了插入基因组引起突变的风险，因此安全性较好，且mRNA很容易通过体外转录过程合成，过程简单，工业化生产成本相对低，可以快速应用于各种疗法，应用潜力极其广泛。
[0003]mRNA在理论上能够表达任何蛋白，通过体内表达功能蛋白，发挥多种疾病的治疗作用，但mRNA的单链结构致使其极为不稳定，易被降解，而且自身携带负电荷，穿过表面同为负电荷的细胞膜递送亦是难题。因此，mRNA递送到细胞内部共有两道屏障：一是递送途中的酶降解；二是静电排斥致使的膜屏障，因此在实际应用过程中，需要对mRNA进行特殊修饰并与递送系统配合才能实现mRNA的胞内表达。脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticle，LNP）是目前最热门的递送技术，承载mRNA的LNP载体除了含有带负电荷的mRNA外，另有四种成分为可电离的阳离子磷脂（ionizable lipids）、中性辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂（PEGylated lipid），可以保护mRNA分子胞外降解，或者促进mRNA分子与细胞膜融合提高转染。目前最常用的mRNA疫苗递送手段除了脂质纳米粒（Lipidnanoparticle，LNP），还有阳离子脂质复合物(lipoplex，LPX)、脂质多聚复合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物纳米颗粒（Polymer nanoparticles，PNP）、无机纳米颗粒（Inorganic nanoparticles，INP）和阳离子纳米乳(Cationic nanoemulsion，CNE)等。
[0004]但是上述现有的mRNA递送系统存在以下问题：一是这些纳米颗粒部分由外源性成分组成，LNPs激活不同的炎症途径，这将导致炎症细胞因子的产生，如IL
‑
1和IL
‑
6，可以启动和维持局部和全身炎症和副作用，目前mRNA疫苗的副作用多数来自于LNP的成分，比如PEG、电离脂质等，会导致发生针对递送系统的天然免疫或适应性免疫；二是制备工艺复杂，mRNA/LNP传统的制备方法是两相混合再经均质技术（高压均质机、高压微射流）或者挤出技术（聚碳酸酯膜过滤器）控制粒径，工艺要求高使得制备难度高；三是这类制剂都需要肌肉注射，使用不方便；四是脂质纳米颗粒需要低温保存，因此非常不稳定。
[0005]综上，亟需一种生物相容性好、易制备、可口服、易保存的mRNA递药系统。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法，该装载mRNA的乳头瘤病毒样纳米颗粒稳定性好，可以确保载入mRNA的乳头瘤病毒样颗粒完整地在体内运输，且具有良好的生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性，相较
于现有技术，目的蛋白的表达量更高。
[0007]根据本申请的一个方面，提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下过程：将mRNA装载于乳头瘤病毒样颗粒的内部，获得所述mRNA递药系统。
[0008]可选地，所述过程具体包括以下步骤：1）将所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液混合后解离，获得溶液A；2）将mRNA加入所述溶液A中混合后，获得溶液B；3）将所述溶液B与终止缓冲液混合后进行重组装，获得含有所述mRNA递药系统的溶液C。
[0009]可选地，所述解离缓冲液包含乙二醇二(β
‑
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇(DTT)、氯化钠(NaCl)和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris
‑
HCl)；优选地，所述解离缓冲液中，所述乙二醇二(β
‑
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)浓度为20
±
1mM，所述二硫苏糖醇(DTT)浓度为40
±
2mM、所述氯化钠(NaCl)浓度为300
±
10mM，所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris
‑
HCl)浓度为100
±
5mM；优选地，所述乙二醇二(β
‑
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)浓度为20mM，所述二硫苏糖醇(DTT)浓度为40mM、所述氯化钠(NaCl)浓度为300mM，所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris
‑
HCl)浓度为100mM。
[0010]优选地，所述解离时间为50~70min，优选地，为60min。
[0011]优选地，所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液的体积比为1：0.9~1.1,优选地，为1：1。
[0012]可选地，所述终止缓冲液包含氯化钙(CaCl2)和二甲基亚砜(DMSO)；优选地，所述终止缓冲液中，所述氯化钙(CaCl2)浓度为25
±
1mM，所述二甲基亚砜(DMSO)的浓度为20
±
1vol％；优选地，所述终止缓冲液中，所述氯化钙(CaCl2)浓度为25mM，所述二甲基亚砜(DMSO)的浓度为20vol％。
[0013]优选地，所述重组装温度为2~6℃，优选地，为4℃。
[0014]可选地，所述步骤3）之后还包括步骤4）用于提纯所述mRNA递药系统：4）首先向蔗糖/PBS层上加入所述溶液C，一次离心后收集一次沉淀，然后加入PBS重悬后，将获得重悬液加入至CsCl溶液中，二次离心收集二次沉淀，最后用滤膜过滤嵌合，获得所述提纯后的mRNA递药系统；优选地，所述一次离心条件为27000r/min 4℃离心3h；优选地，所述二次离心条件为35000r/min 4℃离心20h。
[0015]可选地，所述乳头瘤病毒样颗粒由乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1组成。
[0016]可选地，所述mRNA为经过修饰的mRNA，所述经过修饰的mRNA具有5
’
帽子、5
’
和3
’‑
非翻译区和3
’‑
polyA尾。
[0017]优选地，所述修饰还包括使用化学修饰的核苷酸代替常规核苷酸，用5
‑
甲基胞苷（m5C）代替胞苷，和/或用5
‑
甲基尿苷（m5U）代替尿苷，和/或用N1
‑
甲基腺苷（m1A）、N6
‑
甲基腺苷（m6A）、2
‑
硫尿苷（s2U）、5
‑
甲氧基尿苷（5m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下过程：将mRNA装载于乳头瘤病毒样颗粒的内部，获得所述mRNA递药系统。2.根据权利要求1所述的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法，其特征在于，所述乳头瘤病毒样颗粒由乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1组成。3.根据权利要求1所述的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法，其特征在于，所述mRNA为经过修饰的mRNA，所述经过修饰的mRNA具有5
’
帽子、5
’
和3
’‑
非翻译区和3
’‑
polyA尾；所述修饰还包括使用化学修饰的核苷酸代替常规核苷酸，用5
‑
甲基胞苷（m5C）代替胞苷，和/或用5
‑
甲基尿苷（m5U）代替尿苷，和/或用N1
‑
甲基腺苷（m1A）、N6
‑
甲基腺苷（m6A）、2
‑
硫尿苷（s2U）、5
‑
甲氧基尿苷（5moU）、假尿苷（ψ）或N1
‑
甲基假尿苷（m1ψ）代替腺苷。4.根据权利要求1所述的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法，其特征在于，所述mRNA可以编码抗体蛋白、肿瘤抗原和病原体蛋白中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏凯，常贝贝，王若男，焦圣莲，
申请(专利权)人：健通济南生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：