一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针、检测试剂、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针、检测试剂、检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术针对该区域的DNA序列设计并筛选出了三组引物和TaqMan探针，利用QPCR的方法，可以从分子水平对Ori基因含量进行拷贝数检测，通过标准品制作标准曲线，以计算rAAV产品中的质粒DNA残留量。本方法提供三组可供选择的探针，增强了检测方法适用性和检测能力。强了检测方法适用性和检测能力。强了检测方法适用性和检测能力。

【技术实现步骤摘要】
一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针、检测试剂、检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针、检测试剂、检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]随着近些年基因治疗的快速发展，腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)凭借多种血清型，分别可感染多种细胞、安全性高、特异性强、免疫原性低和表达时间长的特点使其成为基因治疗最有希望的方向之一。在rAAV生产过程中要用到多质粒转染的过程，残留的质粒DNA存在基因片段的自我复制和随机插入机体基因组内的风险，所以，无论是产品生产和药物监管都需要确认工艺对残留DNA的去除程度。2020版《中国药典》公示的三种方法：PicoGreen荧光法、DNA探针杂交法和定量PCR法(简称QPCR法)是生物制剂开发中常用的DNA残留量的检测方法。其中，定量PCR法为2020版《中国药典》新增的方法。
[0003]《中国药典》现有的检测方法中，DNA探针杂交法存在样品干扰导致假阳性，检测量低估，方法不稳定，检测时间过长等问题。荧光染色法存在特异性低，抗干扰差的问题。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，用于解决现有技术中重组AAV病毒中质粒DNA残留检测方法抗干扰差、假阳性多的问题，同时，本专利技术还将提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留的检测试剂、检测试剂盒；此外，本专利技术还将提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留的检测方法。
[0005]Ori基因是质粒复制起始处的序列，是质粒在宿主细胞内自我复制的必要元件，其中ColE1/pMB1/pBR322/pUC来源的Ori元件是目前生物制品领域生产用质粒的主要选择，具有此种Ori元件的质粒在大肠杆菌中有更高的拷贝数。本专利技术针对该区域的DNA序列设计并筛选出了三组引物和TaqMan探针组合，利用QPCR的方法，可以从分子水平对Ori基因含量进行拷贝数检测，通过标准品制作标准曲线，以计算rAAV产品中的质粒DNA残留量。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物；
[0008][0009]所述上游引物为SEQ ID NO.1～3中的至少一种，或与SEQ ID NO.1～3序列具有至少90％同一性的同功能序列；
[0010]所述下游引物为SEQ ID NO.4～6中的至少一种，或与SEQ ID NO.4～6序列具有至少90％同一性的同功能序列；
[0011]所述探针为SEQ ID NO.7～9中的至少一种，或与SEQ ID NO.7～9序列具有至少90％同一性的同功能序列。
[0012]于本专利技术的一实施例中，所述探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团。
[0013]于本专利技术的一实施例中，优选地所述荧光报告基团为FAM，优选地所述荧光淬灭基团为BHQ1。探针的发光基团不限于FAM，淬灭基团不限于BHQ1。
[0014]本专利技术针对该区域的DNA序列设计并筛选出了三组引物和TaqMan探针，利用QPCR的方法，可以从分子水平对Ori基因含量进行拷贝数检测，通过标准品制作标准曲线，以计算rAAV产品中的质粒DNA残留量。
[0015]本专利技术提供三组可供选择的探针，增强了检测方法适用性和检测能力。
[0016]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.1，所述下游引物为SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.7中的至少一种；或与SEQ ID NO.1、4、7序列具有至少90％同一性的同功能序列。
[0017]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.2，所述下游引物为SEQ ID NO.5，所述探针为SEQ ID NO.8中的至少一种；或与SEQ ID NO.2、5、8序列具有至少90％同一性的同功能序列。
[0018]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.3，所述下游引物为SEQ ID NO.6，所述探针为SEQ ID NO.9中的至少一种；或与SEQ ID NO.3、6、9序列具有至少90％同一性的同功能序列。
[0019]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为与SEQ ID NO.1～3序列具有至少95％同一性的同功能序列；
[0020]所述下游引物为与SEQ ID NO.4～6序列具有至少95％同一性的同功能序列；
[0021]所述探针为与SEQ ID NO.7～9序列具有至少95％同一性的同功能序列。
[0022]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.1，所述下游引物为SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.7中的至少一种；或与SEQ ID NO.1、4、7序列具有至少95％同一性的同功能序列。
[0023]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.2，所述下游引物为SEQ ID NO.5，所述探针为SEQ ID NO.8中的至少一种；或与SEQ ID NO.2、5、8序列具有至少95％同一性的同功能序列。
[0024]于本专利技术的一实施例中，所述上游引物为SEQ ID NO.3，所述下游引物为SEQ ID NO.6，所述探针为SEQ ID NO.9中的至少一种；或与SEQ ID NO.3、6、9序列具有至少95％同一性的同功能序列。
[0025]本专利技术的第二方面，提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留的检测试剂，所述检测试剂包括上述引物对和探针。
[0026]本专利技术的第三方面，提供一种所述检测试剂盒包括上述引物对和探针，或所述检测试剂盒包括上述检测试剂。
[0027]本专利技术的第四方面，提供一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留的检测方法，包括如下步骤：
[0028]步骤一、样品经DNase处理后加入Proteinase K体系中，即得预处理样品；
[0029]步骤二、将预处理样品与QPCR反应溶液均加入PCR反应板中混匀，上机进行QPCR扩增反应，即可；
[0030]其中，所述QPCR反应溶液包括上述引物对和探针，或所述QPCR反应溶液包括上述检测试剂。
[0031]本专利技术所用的扩增试剂为Roche的FastStart Universal Probe Master(Rox)或者等效试剂；
[0032]于本专利技术的一实施例中，将待测样品先后进行DNase I和Protein K孵育处理，然后一定倍数的稀释。本专利技术提供rAAV样品的前处理方法，流程操作简单，可靠。
[0033]于本专利技术的一实施例中，样品通过如下方式进行处理：
[0034](1)、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQ ID NO.1～3中的至少一种，或与SEQ ID NO.1～3序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述下游引物为SEQ ID NO.4～6中的至少一种，或与SEQ ID NO.4～6序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述探针为SEQ ID NO.7～9中的至少一种，或与SEQ ID NO.7～9序列具有至少90％同一性的同功能序列。2.根据权利要求1所述的用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO.1，所述下游引物为SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.7中的至少一种；或与SEQ ID NO.1、4、7序列具有至少90％同一性的同功能序列。3.根据权利要求1所述的用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO.2，所述下游引物为SEQ ID NO.5，所述探针为SEQ ID NO.8中的至少一种；或与SEQ ID NO.2、5、8序列具有至少90％同一性的同功能序列。4.根据权利要求1所述的用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO.3，所述下游引物为SEQ ID NO.6，所述探针为SEQ ID NO.9中的至少一种；或与SEQ ID NO.3、6、9序列具有至少90％同一性的同功能序列。5.根据权利要求1～4任一项所述的用于重组AAV病毒中质粒DNA残留检测的引物对和探针，其特征在于，所述上游引物为与SEQ ID NO.1～3序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林森，李发院，孙红飞，陈智，陈琪，
申请(专利权)人：上海药明生基医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：